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Prática de oxidação de açúcares. Cinética enzimática.
Tipologia: Exercícios
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Curso Técnico Em Química Industrial Bioquímica
Cinética Enzimática.
Aloa Souza
DATA DE REALIZAÇÃO: 28/10/
COMPONENTES DO GRUPO Gabrielle Guimarães Jean Colaço Matheus Dantas Raphael dos Santos Zelia Fernanda da Silva
A cinética enzimática estuda as reações químicas catalisadas pelas enzimas, em especial a velocidade de reação. O estudo da cinética de uma enzima permite elucidar os pormenores do seu mecanismo catalítico, o seu papel no metabolismo, como é controlada a sua atividade na célula e como pode ser inibida a sua atividade por drogas ou venenos, ou potenciada por outro tipo de moléculas. A cinética das reações enzimáticas tem como objetivos principais os seguintes:
temperatura, pH, concentração de ativadores e inibidores);
transformações com alguns dos fatores que as afetam;
O estudo da cinética enzimática dividi-se em duas vertentes, sendo elas a Michaeliana e a Não-Michaeliana. A primeira considera que a reação enzimática ocorre em dois passos, determinando a velocidade em função das constantes de equilíbrio da reação e das concentrações de substrato e enzima. Já a segunda é utilizada para reações catalisadas por enzimas alostéricas. Uma reação catalisada por uma enzima utiliza a mesma quantidade de substrato e gera a mesma quantidade de produto que uma reação não catalisada. Tal como ocorre em outros tipos de catálise, as enzimas não alteram em absoluto o equilíbrio da reação entre substrato e produto. Ao contrário do que acontece em outras reações químicas, as enzimas saturam- se. Isto significa que com uma maior quantidade de substrato, mais centros catalíticos estarão ocupados, o que incrementará a eficiência da reação, até ao momento em que todos os sítios possíveis estejam ocupados. Nesse momento ter-se-á alcançado o ponto de saturação da enzima e, embora adicione-se mais substrato, não aumentará mais a eficiência. As duas propriedades cinéticas mais importantes de uma enzima são: o tempo que demora a saturar-se com um substrato em particular e o seu ponto máximo de saturação. O conhecimento destas propriedades torna possível formular hipóteses sobre o comportamento de uma enzima no ambiente celular e prever como responderá frente a mudanças nessas condições.
Fazer a análise da atividade enzimática frente a diferentes agentes extrínsecos e intrínsecos e determinar o resultado da influência da concentração de substrato, temperatura e pH na catálise enzimática, tomando como referência a dosagem de açurares redutores.
banho-maria (37°C) e banho fervente (100°C). Logo em seguida, adicionou-se 0,5mL de enzima a cada um dos 3 tubos e deixou-se reagir por 15 minutos e adicionou-se DNS para cessar a reação e retirou-se os tubos dos banhos onde encontravam-se e levou-os ao banho fervente durante 5 minutos. Após resfriamento, adicionou-se 6,5mL de água aos mesmos, homogeneizando-os e observando a coloração formada.
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Influencia da Concentração de Substrato. Obtiveram-se as seguintes absorbâncias no espectrofotômetro:
Tubo Absorbância
2 0, 3 0, 4 0, 5 0, 6 0, 7 0, Tab.2: Absorbâncias obtidas no espectro. O tubo 1 não entrou na listagem pois ele é realizado para efeito de ensaio em branco, o valor lido neste tubo é descontado nos outros automaticamente pelo programa que realiza a leitura. De posse da curva analítica padrão de concentração de glicose fornecida, foi possível calcular, por projeção na equação da reta, as respectivas concentrações de glicose nos tubos 2 a 7. A reta possui equação definida por y = 0,6364x – 0,0335, onde y é substituído pela absorbância lida e x corresponde a concentração no tubo, baseando-se nestas informações, obteve-se as seguintes concentrações:
Tubo Concentração (mg/mL) 2 0, 3 0, 4 1, 5 1, 6 1, 7 1, Tab. 3: Valores de concentração de glicose após clivagem de sacarose catalisada por invertase.
Com o valor das concentrações, é possível descobrir a quantidade de glicose produzida em cada tubo e a sua velocidade de formação, demonstrado abaixo:
Tubo 2:
Tubo 3:
Tubo 4:
Tubo 5:
Tubo 6:
Tubo 7:
Com os dados de velocidade de formação de glicose, e sabendo-se a concentração de sacarose de cada tubo (que é determinada apenas pela diluição da solução de sacarose utilizada, pelo volume final), é possível construir o gráfico velocidade de reação versus concentração de substrato, que expressa a influencia do mesmo na atividade enzimática.
Vmáx e K (^) m só podem ser calculados quando V 0 é medida em função de várias concentrações de substrato. E para tal determinação é necessário que com estes valores
O gráfico dos duplos recíprocos permite a determinação precisa de Km e V (^) máx já que na extrapolação dos dados experimentais, chega-se a uma situação em que 1/V 0 =1/ Vmáx quando 1/[S] = 0. Ou seja, quando a concentração de substrato for muito alta. Km é uma medida da afinidade da enzima pelo substrato. Estabelecendo-se os seguintes parâmetros: K (^) m ALTO = BAIXA afinidade e K (^) m BAIXO = ALTA afinidade. A determinação da influencia de substrato pode ser realizada apenas se as condições de temperatura ótima, pH ótimo e concentração de enzima forem mantidas. É importante ressaltar que a formação de produto é diretamente proporcional a concentração de substrato, e que a velocidade de catálise só será independente da mesma , se esta estiver em excesso. Pois em baixas concentrações de substrato a velocidade de reação é de primeira ordem, em outras palavras, proporcional a concentração de substrato. Já quando esta está em excesso a velocidade de reação é de ordem zero, mantêm-se constante e passa a independer da concentração de substrato.
Influência do pH: Obteve-se as seguintes colorações neste procedimento:
Tab. 4: Resultados da atividade enzimática em diferentes pH. Tubo Tampão Cor
1 Fosfato pH 8,0 Amarelo-acastanhado
2 Acetato pH 3,6 Castanho 3 Acetato pH 5,0 Castanho escuro
Em sua maioria as enzimas apresentam um valor de pH para o qual sua atividade é máxima, a velocudade da reação diminui a medida que o pH se afasta desse valor ótimo, que é característico para cada enzima, mas com freqüência, está próximo do pH neutro. Existe uma concentração hidrogeniônica que propicia um determinado arranjo de grupos protonados e desprotonados, que leva a molécula de enzima a conformação ideal para exercer seu papel catalítico. Esse pH é denominado de pH ótimo, e depende
diretamente do número e tipo de grupos ionizáveis que uma enzima apresenta, ou seja, depende, intimamente, da estrutura primaria da mesma. Em contraponto, quando o substrato contém grupos ionizáveis, as variações de pH também poderão afetar sua carga. Foi possível observar que a enzima invertase, apresentou melhor desempenho catalítico no tampão fosfato pH 5,0, onde ouve forte escurecimento. É possível notar também que em pH mais ácido sua atividade catalítica cai, mas menos do que quando o pH fica mais alcalino, que foi onde observou-se coloração mais clara (mais próxima a coloração original do DNS). Logo o pH ótimo para a enzima invertase gira em torno de 3, < pH < 5,0.
Influência da Temperatura: Obteve-se os seguintes resultados para este experimento:
Tab. 5: Resultados da atividade enzimática em diferentes temperaturas Tubo Meio de trabalho Coloração 1 Gelo (4°C) Amarelo-alaranjado
2 Banho-Maria (37°C) Castanho Escuro
3 Água Fervente (100°C) Laranja
A influência da temperatura sobre a cinética da catálise enzimática é comumente dividida em duas fases distintas: a primeira, em que, aumentos de temperatura levam a aumentos de velocidade de reação, pelo simples fato de aumentar energia cinética e a entropia das moléculas presentes no meio reacional. Esse efeito pode ser observado num intervalo de temperatura compatível com a manutenção da estrutura espacial da enzima. Temperaturas mais altas levam a desnaturação da enzima por alterarem as ligações químicas que mantêm a estabilidade da molécula e a estrutura tridimensional. Se a temperatura fornecida for capaz de romper as ligações hidrogênio, estas que são relativamente resistentes ao calor, desencadeia-se uma seqüência de alterações estruturais, levando a enzima a um novo estado conformacional ou a um estado sem estrutura definida. A temperatura que provoca a desnaturação da enzima, geralmente, está pouco acima da temperatura ótima da mesma. O efeito da temperatura em uma enzima, depende de outros fatores, dentre eles o pH, a força iônica do meio e a presença ou não de ligantes. Geralmente, o substrato
CISTERNAS , Josè Raul; VARGA , José; MONTE , Osma / Fundamentos da Bioquímica Experimental / 2°edição – São Paulo. Editora Atheneu, 2001.
Estágio de Docência – Cinética Enzimática. Por Juliana Ribeiro Mariotto. http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/apostilas/Apostila_cinetica_enzimatica_ju.pdf
Cinética Enzimática http://www.bioqmed.ufrj.br/enzimas/cinetica.pdf
Enzimas http://www.bioqmed.ufrj.br/enzimas/cinetica.pdf Enzimas e suas aplicações. – Cinética Enzimática. Por Agenor Furigo Junior e Ernandes B. Pereira. http://www.bioqmed.ufrj.br/enzimas/cinetica.pdf
[RBEBBM] Cinética Enzimática www.ib.unicamp.br/lte/rbebbm/visualizarMaterial.php?idMaterial=
