Engenharia Biomédica
Bioquímica e Biologia Molecular
Relatório
Cinética da Enzima Invertase
Relatório realizado por:
Ana Calhau nº54605
Dárcio Silva nº54214
José Frazão nº54198
1º Semestre, Ano Lectivo 2005/2006
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relatório cinética enzimática, Trabalhos de Bioquímica
relatório cinética enzimática- bioquímica
Tipologia: Trabalhos
2019
1 / 14
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Engenharia Biomédica
Bioquímica e Biologia Molecular
Relatório
Cinética da Enzima Invertase
Relatório realizado por:
Ana Calhau nº Dárcio Silva nº José Frazão nº
1º Semestre, Ano Lectivo 2005/
Sumário
Usam-se diversas abordagens no estudo do mecanismo de acção de enzimas purificadas, mas a abordagem principal é determinar a taxa da reacção enzimática e como muda em resposta à mudança dos parâmetros experimentais, esta é conhecida como cinética enzimática. Neste trabalho experimental o objectivo era estudar a cinética da enzima invertase, ou seja, determinar o valor da velocidade máxima (máxima velocidade a que a enzima degrada o substrato) e determinar o valor do Km que é uma medida da afinidade enzimática para o substrato (essa afinidade é igual a 1/km). Se Km for elevado a afinidade é baixa. A invertase é uma enzima que catalisa a degradação da sacarose em glucose e frutose. Inicialmente, obteve-se a absorvância e a concentração dos açúcares redutores (tendo-se feito dois ensaios). Depois, calculou-se a velocidade de reacção para cada concentração inicial de sacarose. Para se obter os valores usou-se a equação da recta Y=0,0004x-0,0186, em que Y é a absorvância. Em seguida colocaram-se estes resultados num gráfico (concentração de sacarose x velocidade de reacção), obtendo-se uma curva de Michaelis-Menten (fig.1).
Fig.1 – Variação da velocidade de reacção em função da concentração de substracto – curva de Michaelis-Menten.
Esta curva é descrita pela equação que leva o mesmo nome:
Apesar de ser possível calcular o valor de Km e da velocidade máxima através desta curva é frequente utilizar-se a representação gráfica de 1/v em função de 1/[S] – representação de Lineweaver-Burk- pois torna mais simples o estudo da cinética bioquímica, já que o
Resultados
Nos primeiros resultados, após se ler a densidade óptica, obtiveram-se logo valores máximos para a velocidade. Assim, reduziu-se a quantidade de invertase utilizada.
Após a redução a 1/5 de invertase quantos aos resultados, obteve-se, relativamente à cor, que esta passava de transparente para amarelo, após adição da invertase, qualquer que fosse a concentração de sacarose. Após passagem pelo banho de água a 100ºC passava a castanho. Contudo, para os tubos aos quais não foi adicionado invertase e que correspondem ao tempo zero para cada uma das concentrações de sacarose verificou-se a passagem do transparente para o amarelo e a permanência desta cor. Quanto aos valores obtidos para a absorvância e para a concentração os resultados são os seguintes:
9 Valores obtidos para as concentrações de 15, 30 e 45 g/l
Ensaio 1
Concentração de sacarose 15g/L Absorvância^ [] (mg/L)^ Tempo (s) 0 0,1^ 296,5^0 1 0,24^ 646,5^60 2 0,59^ 1521,5^120 3 0,85^ 2171,5^180 4 1 2546,5^240 5 1,1^ 2796,5^300 6 1,2^ 3046,5^360 7 1,35^ 3421,5^420
Concentração de sacarose 30g/L Absorvância^
[] (mg/L) (^) Tempo (s)
0 0,011^74 1 0,525^1359 2 1,112^ 2826,5^120 3 1,561^3949 4 1,867^4714 5 2,936^ 7386,5^300 6 2,37^ 5971,5^360 7 2,59^ 6521,5^420
Concentração de sacarose 45g/L Absorvância^
[] (mg/L) (^) Tempo (s)
0 0,018^ 91,5^0 1 0,622^ 1601,5^60 2 1,171^2974 3 1,693^4279 4 1,967^4964 5 2,35^ 5921,5^300 6 2,597^6539 7 2,697^6789
Ensaio 2
Concentração de sacarose 15g/L
Absorvância [] (mg/L) (^) Tempo (s)
0 0,032 126,5 (^0) 1 0,574 1481,5 (^60) 2 1,021 (^2599 ) 3 1,392 3526,5 (^180) 4 1,76 4446,5 (^240) 5 2,048 5166,5 (^300) 6 2,338 5891,5 (^360) 7 2,516 6336,5 (^420)
Concentração de sacarose 30g/L
Absorvância [] (mg/L) (^) Tempo (s)
0 0,023 (^104 ) 1 0,565 (^1459 ) 2 0,921 (^2349 ) 3 1,21 3071,5 (^180) 4 1,52 3846,5 (^240) 5 1,845 (^4659 ) 6 2,121 (^5349 ) 7 2,235 (^5634 )
Concentração de sacarose 45g/L
Absorvância [] (mg/L) (^) Tempo (s)
0 0,009 (^69 ) 1 0,779 (^1994 )
Concentração de
sacarose 60 g/L Absorvância
Concentração de sacarose 75g/L Absorvância
Concentração de sacarose 100g/L Absorvância
Assim, a média para cada grupo de valores obtidos é: Concentração de Concentração de Concentração de
- 3 1,997 5039
- 4 2,406 6061,5
- 5 2,598 6541,5
- 6 2,759 6944
- 7 2,836 7136,5
- Ensaio
- 0 0,185 509,000 [] (mg/L) Tempo (s)
- 1 0,850 2171,500
- 2 1,400 3546,500
- 3 2,203 5554,000
- 4 2,479 6244,000
- 5 2,626 6611,500
- 6 2,814 7081,500
- 7 2,848 7166,500
- 0 0,58 1496,5 [] (mg/L) Tempo (s)
- 1
- 2 1,456 3686,5
- 3 2,04 5146,5
- 4 2,405
- 5 2,72 6846,5
- 6 - -
- 7 -
- 0 0,038 141,5 [] (mg/L) Tempo (s)
- 1 0,787
- 2 1,4 3546,5
- 3 1,864 4706,5
- 4 2,191
- 5 2,546 6411,5
- 6 2,741
- 7 2,666 6711,5
- 0 0,066 211,5 sacarose 15g/L Absorvância [] (mg/L) Tempo (s)
- 1 0,407^1064
- 2 0,8055 2060,25
- 3 1,121^2849
- 4 1,38 3496,5
- 5 1,574 3981,5
- 6 1,769^4469
- 7 1,933^4879
- 0 0,017^89 sacarose 30g/L Absorvância [] (mg/L) Tempo (s)
- 1 0,545^1409
- 2 1,0165 2587,75
- 3 1,3855 3510,25
- 4 1,6935 4280,25
- 5 1,845^4659
- 6 2,2455 5660,25
- 7 2,4125 6077,75
- 0 0,0135 80,25 sacarose 45g/L Absorvância [] (mg/L) Tempo (s)
- 1 0,7005 1797,75
- 2 1,2375 3140,25
- 3 1,7635 4455,25
- 4 2,2235 5605,25
- 5 2,4085 6067,75
- 6 2,7035 6805,25
- 7 2,7205 6847,75
Desta forma, graficamente obtemos:
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tempo (min)
Conc de Açucares Reduzidos (g/L )
Conc.S acaros e 15g/L Conc.S acaros e 30g/L Conc.S acaros e 45g/L Conc.S acaros e 60g/L Conc.S acaros e 75g/L Conc.S acaros e 100g/L
Pelo cálculo do declive das rectas anteriores obtém-se a curva de Michaelis-Menten:
0
0,
0,
0,
0,
1
1,
1,
1,
1,
0 15 30 45 60 75 100 C onc. Sacaros e (g/L )
Velcidades (g/L .min)
Série
Desta forma (pela aplicação das fórmulas apresentadas no sumário), obtém-se:
Km=11,5 g/L (33,6mM)
Vmáx=1,6 g/(L.min) Pela inversão dos valores dos eixos acima obtém-se o gráfico de Lineweaver-Burk:
y = 6,806x + 0,
-0,
-0,
-0,
0,
0,
0,
0,
0,
1,
1,
1,
-0,1 -0,05 0 0,05 0,
1/[ ]
Série Linear (Série1)
Mais uma vez, pela aplicação das fórmulas apresentadas no sumário, obtém-se:
Km=12,52 g/L (36,6mM)
Vmáx=1,84 g/(L.min)
- Mau manuseamento do material em especial das pipetas. Podem surgir erros ao pipetar e ao transferir para o recipiente;
- O facto de ser impossível cumprir escrupulosamente com os tempos estipulados no protocolo;
- Aproximações no tratamento dos resultados;
- Erros de leitura no espectrofotómetro, nomeadamente, erros de paralaxe, uma vez que os valores foram lidos por nós;
- O facto de terem sido desprezados vários pontos no traçado das rectas cujo declive dá a velocidade. A escolha dos pontos pode não ter sido a mais correcta. Como as velocidades foram utilizadas na determinação das constantes cinéticas, pode ter ocorrido propagação de erros. Contudo, apesar de todas as diferenças verificadas, pode concluir-se que se obteve valores aceitáveis de Km e de velocidade máxima (constantes cinéticas) pela leitura da recta de Lineweaver-Burk.
Bibliografia
- Campos, Luís S., Entender a Bioquímica , 4ª edição. Escolar Editora. Lisboa, 2005;