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cinetica enzimatica
Tipologia: Notas de estudo
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Enzimas são catalisadores biológicos, formados por longas cadeias de moléculas pequenas, chamadas de aminoácidos. São portanto, um tipo de proteína com atividade catalítica, sendo encontradas na natureza em todos os seres vivos. Sua função é viabilizar a atividade das células, quebrando moléculas ou juntando-as para formar novos compostos. A singularidade desses compostos decorre do elevado grau de especificidade ao substrato em condições moderadas, sob as quais atuam. Algumas enzimas são específicas para determinado tipo de ligação química, como, por exemplo, a capacidade da α-amilase de romper unicamente as ligações α-1,4 das moléculas de amido. Outras são específicas para um tipo particular de isômero óptico, como, por exemplo, a oxidação da β-D-glicose pela glicose oxidase. São os catalisadores potentes. “Toda enzima é uma PROTEÍNA , mas nem toda proteína é uma ENZIMA”.
1.1. Considerações iniciais Proteínas São as moléculas mais abundantes nas células, cerca de 30-70%. Contém resíduos de aminoácidos unidos por ligações peptídicas.
Constituintes básicos: Carbono 50% Oxigênio 23% Nitrogênio 16% Hidrogênio 7% Enxofre 3% A massa molecular das proteínas: 6000 a 1.10 6 Da. A classificação das proteínas dividem-se em duas classes principais: Proteínas fibrosas e proteínas globulares. As estruturas das proteínas são descritas em níveis: primária, secundária, terciária e quaternária. As enzimas pertencem a classe das proteínas globulares, tendo como estrutura a terciária.
Quimicamente, enzimas são proteínas com estrutura especial contendo um centro ativo denominado apoenzima e, às vezes, um grupo prostético (cofator) que pode ser orgânico (coenzima) ou um íon metálico ativo. A habilidade com que a enzima se liga ao substrato se denomina “atividade biológica” e depende: a) estrutura da proteína; b) número de cadeias peptídicas; c) arranjo dessas cadeias na molécula; d) natureza do substrato; e) natureza do grupo prostético (se houver). Cada organismo vivo produz uma grande variedade de enzimas, a maioria delas em pequenas quantidades. Algumas são produzidas em grandes quantidades por certos microrganismos, que as excretam para o meio externo. As enzimas extracelulares são capazes de digerir materiais nutritivos insolúveis, como celulose, proteínas e amido. Algumas destas enzimas são usadas em alimentos, bebidas, laticínios, nas industrias farmacêuticas, têxtil e de detergentes. Sua utilização é feita em processos biotecnológicos industriais, ajudando a reduzir a poluição, muitas vezes substituindo processos químicos nefastos ao meio ambiente. São produzidas comercialmente em grande escala, por síntese microbiana, através de fungos ou de bactérias. O processo de produção é normalmente anaeróbico e o meio de cultura similar aos usados para a fermentação de síntese de antibióticos. As enzimas são especialmente importantes porque agem em grupos funcionais específicos, catalisando reações de forma estereoespecífica, formando somente um ou dois enantiômeros possíveis. Algumas características importantes das enzimas podem ser citadas, tais como: ♦ São produtos naturais biológicos. ♦ Apresentam um alto grau de especificidade. ♦ Reações baratas e seguras. ♦ Possuem mecanismo de turnover, desempenhando a mesma função consecutivamente, sem serem consumidas no processo.
♦ São altamente eficientes, acelerando a velocidade das reações catalisadas. ♦ São econômicas, reduzindo a energia de ativação necessária para a reação catalisada. ♦ São biodegradáveis, sendo o lodo residual reciclado como biofertilizante. ♦ Não são tóxicas. ♦ Altamente eficientes: aumentando a velocidade de reação de 10^8 a 10^11 vezes mais rápida. ♦ Condições brandas.
Comparação das Enzimas com os Catalisadores Químicos Característica Enzimas Catalisadores Químicos Especificidade ao substrato alta baixa Natureza da estrutura complexa simples Sensibilidade à T e pH alta baixa Condições de reação (T, P e pH)
suaves drástica (geralmente)
Custo de obtenção (isolamento e purificação)
alto moderado
Natureza do processo batelada contínuo Consumo de energia baixo alto Formação de subprodutos baixa alta Separação catalisador/ produtos
difícil/cara simples
Atividade Catalítica (temperatura ambiente
alta baixa
Presença de cofatores sim não Estabilidade do preparado baixa alta Energia de Ativação baixa alta Velocidade de reação alta baixa
Mercado Global de Enzimas Setor Enzimas Milhões de Dólares (US$) Produção de amido (^) α-amilase, glucoamilase, glucose isomerase
Detergentes Protease, lipase, amilase 450 Têxteis Amilases 150 Tratamento de couro Enzimas diversas 25 Papel e celulose Celulases 25 Laticínios Lactase 150 Papaína - 25 Pectinesterases - 30 Total 1.355 bilhões Dados de 1998
2-GENERALIDADES
2.1- ENERGIA DE ATIVAÇÃO Termodinamicamente falando, as enzimas são catalisadores biológicos que abaixam seletivamente as energias de ativação das reações químicas vitais. Energia de ativação, é a energia mínima necessária para que uma molécula de reagente ou de
substrato S alcance o estado de transição S••P≠^ e daí se tornar uma molécula de
produto P. A velocidade da reação S→P depende do número de moléculas de S que alcançam o estado de transição por unidade de tempo. Na presença de uma enzima apropriada, a temperatura ambiente fornece uma quantidade suficiente de moléculas reagentes com a necessária energia de ativação. Uma reação catalisada por enzima pode processar a 25o^ C, 10^8 a 10^11 vezes mais rapidamente que a mesma reação não catalisada. As enzimas não afetam o ∆G (energia livre de Gibbs) ou a Keq (constante de equilíbrio) de uma reação. Elas simplesmente aceleram a velocidade com a qual a reação alcança o equilíbrio. No equilíbrio, as reações em ambos os sentidos são iguais.
Portanto: S P
vf = k1 [S] = vd = k (^) –1 [P] Keq = [[ ]^ PS]= (^) kk−^11 onde,
vf = velocidade de formação do produto P. vd = velocidade de dissociação do produto P. [S] = concentração de substrato S. [P] = concentração de produto P. Na presença de uma enzima apropriada, k 1 e o k-1 crescem na mesma ordem. Se k 1 aumenta de 10^6 vezes, o k (^) -1 deve também aumentar de 10^6 vezes. O ∆G e o Keq permanecem invariáveis (figura 1).
FIGURA 1- ∆G e Ea de (a) uma reação não enzimática; (b) uma reação enzimática.
2.2- O SÍTIO ATIVO Sua função é de ligação e catalítica. A seqüência total de uma reação enzimática pode ser descrita como: S + E → ES → EP → E + P
k (^1) k- (^1)
S S
Ea E (^) a
(a) (b)
Nível de Nível deenergia energia (S••P) ≠
∆G
∆G
Entende-se por cinética enzimática a análise quantitativa do efeito de cada um dos fatores que influencia a atividade enzimática avaliada através do aumento ou redução da velocidade da reação catalisada.
A atividade da enzima, e, portanto a cinética enzimática é determinada pela concentração da enzima, concentração de cofatores, concentração e tipo de inibidores (quando presentes) e ainda pH, T e força iônica.
3.1. CATÁLISE
Característica do catalisador
Modificar a velocidade da reação, sem ser nela consumido ou aparecer entre os produtos. Não apresenta efeito termodinâmico global: energia livre liberada ou absorvida na reação independente da presença ou ausência do catalisador. Atua pela redução da Energia de Ativação. Catalisador mais reagente: estados de transição mais estável→redução da
energia de ativação.
Influência da Concentração de Enzima
Sob determinadas condições, a velocidade de transferência do substrato em produto é proporcional à quantidade de enzima. Desvios da linearidade podem ocorrer devido a: presença de inibidores na própria solução de enzima; presença de substâncias tóxicas; presença de um ativador que dissocia a enzima; e limitações impostas pelo método de análise. A fim de se evitar o efeito causado por estes fatores recomenda-se utilizar nos ensaios cinéticos, sempre que possível: enzimas com alto grau de pureza; substratos puros; e método de análise confiável.
Influência do pH Geralmente as enzimas são ativas numa faixa restrita de pH e na maioria dos casos há um pH ótimo definido.
O efeito do pH sobre a afinidade pode ser eliminado utilizando-se altas concentrações de substrato de modo a se saturar a enzima em todos os valores de pH; e o efeito do pH sobre a enzima deve-se às variações no estado de ionização dos componentes do sistema à medida que o pH varia. Como as enzimas são proteínas contém muitos grupos ionizáveis, elas existem em diferentes estados de ionização, por isso, a atividade catalítica é restrita a uma pequena faixa de pH (HARTMEIER).
A atividade da enzima deve ser então medida no pH ótimo. A estabilidade de uma enzima ao pH depende de muitos fatores como: temperatura, força iônica, natureza química do tampão, concentração de vários preservativos (por exemplo, glicerol, compostos sulfídricos), concentração de íons metálicos contaminantes, concentração de substratos ou cofatores da enzima e concentração da enzima.
Efeito da Temperatura A atividade catalítica das enzimas é altamente dependente da temperatura, como no caso dos catalisadores convencionais, porém, à medida que se eleva a temperatura dois efeitos ocorrem simultaneamente: (a) a taxa de reação aumenta, como se observa na maioria das reações químicas; e (b) a estabilidade da proteína decresce devido a desativação térmica. A influência da temperatura sobre a atividade da enzima é geralmente, representada em termos de atividade ou velocidade de reação em função da temperatura, ou seja, a maioria das reações químicas se processa a uma velocidade maior à medida que a temperatura aumenta.. O efeito da temperatura de uma enzima depende de um número de fatores inculem o pH e a força iônica do meio e a presença ou ausência de ligantes. Os substratos freqüentemente protegem a enzima da desnaturação pelo calor. No processo de desnaturação térmica ocorre a perda da atividade biológica da enzima. Toda enzima tem uma temperatura ótima para que atinja sua atividade máxima, ou seja, é a temperatura máxima na qual a enzima possui uma atividade constante por um período de tempo.
Substituindo-se para [ES]:
p
Rearranjando-se, tem-se:
Se v = kp [ES], então kp [E]t = Vmáx é a velocidade máxima que será observada quando toda a enzima estiver presente sob a forma de ES, então:
Ou v V
m ax^ =^ K s + [S] (2)
Equação de Henri-Michaelis-Menten
A equação (2) nos dá a velocidade “instantânea” ou “inicial” relativa a Vmáx para uma dada concentração de substrato. A equação só é válida se v é medida num tempo pequeno o suficiente para que [S] permaneça praticamente constante. Pra isto não mais do que 5% do substrato devem ser utilizados durante o tempo de ensaio.
3.3. TRATAMENTO DO ESTADO ESTACIONÁRIO (BRIGGS E HALDANE) Se a enzima estiver presente em quantidades “catalíticas” (isto é, [S] >> [E]t ), então a velocidade de aparecimento de ES será praticamente igual à velocidade de desaparecimento de ES caracterizando-se um estado estacionário no qual a concentração de ES permanece praticamente constante num certo período de tempo.
A equação de velocidade pode ser derivada de maneira muito similar à equação anteriormente descrita. Neste caso, ES será obtido da equação do estado estacionário ao invés de expressões de equilíbrio:
E + S ES E + P
(2a)
Analisando a seqüência de reação, verifica-se que: Velocidade de formação de ES = k 1 [E][S] Velocidade de decomposição de ES = k-1 [ES] + kp [ES] = (k-1 + kp )[ES] No estado estacionário, d[ES]/dt = 0 (não há acúmulo) ou, k 1 [E][S] = (k-1 +kp )[ES]
Resolvendo para [ES]:
1 p 1 m
Assim:
v k [E]p t^ = +
m m
m m
Km é diferente de Ks:
k 1 k-
kp
A curva de v vs. [S] é uma hipérbole retangular perfeita cujos limites são Vmáx e -Km. A curvatura é fixa independentemente dos valores de Km e Vmáx. Em conseqüência, a razão das concentrações do substrato para quaisquer duas frações de Vmáx é constante para todas as enzimas que obedecem à cinética de Henri-Michaelis- Menten.
FIGURA 5 - Gráfico de v vs. [S]
4- ORDEM DE REAÇÃO A curva de v vs. [S] apresenta 3 regiões distintas onde a velocidade apresenta uma resposta característica à medida que [S] aumenta (figura 6a). Em concentrações muito baixas de substrato (por exemplo, [S] < 0.01Km ), a curva de v vs. [S] é praticamente linear (figura 6b). Esta é a região de cinética de primeira ordem. Em concentrações de substrato muito altas ([S] > 100Km), a velocidade é praticamente independente da concentração de substrato. Esta é a região de cinética de ordem zero (figura 6c). Para as concentrações intermediárias de substrato, a relação entre v e [S] não segue nem uma cinética de primeira ordem nem uma de ordem zero.
K (^) m
0.5V (^) máx
V (^) máx Velocidade inicial v
Velocidade inicial v
Concentração de substrato S
v
ordem zero
FIGURA 6- (a) Gráfico de v vs. [S] numa grande faixa de [S]. (b) Gráfico de v vs. [S] onde [S]<<K (^) m. (c) Gráfico de v vs. [S] onde [S]>Km.
4.1- CINÉTICA DE PRIMEIRA ORDEM A relação linear entre v e [S], quando [S] << Km pode ser deduzida a partir da equação de Henri-Michaelis-Menten.
v = (^) KV m^ m ax+ [S][S]
Quando [S] << Km ⇒ (^) v = V^ [S] K
m ax m
ou v = k[S] (4)
k = constante de velocidade de primeira ordem para a equação total. k = Vmáx /Km = moles x litro -1^ x min-1^ / moles x litro-1^ = min- A equação indica que quando [S] é muito pequena, a velocidade absoluta diminui a cada momento, à medida que [S] decresce (figura 7a). Porém, em certo momento, uma fração constante de substrato presente se transforma em produto: − d S = ⇒ d t
[ ] (^) v = k [S ] k = -d[S ] / [S ] d t − d S = d t
[ ] (^) v = q u a n tid a d e d e [S ] u tiliz a d a p o r u m p e q u e n o p e rio d o
Concentração de substrato S (^) Concentração de substrato S
1 a^ ordem
v
Concentração de substrato S
(a)
(b)
(c)
Então, um gráfico de [S] vs. t é linear, com uma inclinação de -k/2.3 e uma interseção de log[S] 0 no eixo de log[S] (figura 8). Quando [S] = ½ [S] 0 , t = “meia-vida”, t (^) 1/. t (^) 1/2 = tempo necessário para converter em produto metade do substrato originalmente presente. O t (^) 1/2 é constante para reações de 1a^ ordem e está relacionado ao k: 2 3. log (^) 0 5^1. = kt 1 / 2 2 3. log^ k 2 =t 1 / 2 0 693. (^1) / 2 k =^ t
FIGURA 8- Gráfico semilog da forma integrada da equaçào da velocidade de primeira ordem.
Quando [S] >> Km, o Km no denominador da equação de Henri- Michaelis-Menten pode ser ignorado e a equação simplificada:
v = Vmáx (9)
Inclinação = -k/2.
lo g [^ S 2 ]^0
log[S] 0
log[S]
t1/2 Tempo
Para facilitar a determinação das constantes cinéticas, os dados são geralmente lançados em gráficos lineares.
5.1- GRÁFICOS DOS RECÍPROCOS DE LINEWEAVER-BURK: 1/ v VS. 1/[S] É baseado no rearranjo da equação de Henri-Michaelis-Menten numa forma linear (y = mx + b): v V o^ v =
m ax [S] = m
K m S Invertend^ :^
V m ax
1 v =
m m ax Separando os termos: 1 1 v =^
m m ax ×^ [ S] m ax ou 1 1 v =^
m m ax ×^ [ S ] m ax
1/V (^) máx
1/ v
