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DIVULGAÇÃO ELETROFORESE CAPILAR: CONCEITOS BÁSICOS Marina F. M. Tavares Instituto de Química - Universidade de São Paulo - CP 26077 - 05599-970 - São Paulo - SP Recebido em 19/4/95; aceito em 26/10/95 CAPILLARY ELECTROPHORESIS: BASIC CONCEPTS. Over the past fifteen years, capillary electrophoresis has emerged as a very resourceful alternative method for the separation of a va- riety of solutes of industrial, clinical, biomedical and environmental importance. Relevant aspects of the technique such as high efficiency, high resolving power, high speed, full automation, and a diversity of injection and detection schemes have been extensively investigated. In this work, an overview of the basic principles underlying electrophoretic and electroosmatic migrations as well as the instrumental aspects of the technique have been thoroughly reviewed. Keywords: capillary electrophoresis; electroosmotic flow; mobility. INTRODUÇÃO Eletroforese é uma técnica de separação baseada na migra- ção diferenciada de compostos iônicos ou ionizáveis, em um campo elétrico.!2 Vários modos de separação, com mecan mos singulares e seletividade característica, são possíveis: fronteira móvel, zona, isotacoforese e focalização isoelétrica. A figura 1 apresenta, esquematicamente, a separação progres- siva de dois solutos pelos quatro modos da eletroforese. FRONTEIRA MÓVEL . Il [E - ZONA + E:il = . Isoracoromese «mi DEE MEE FOCALIZAÇÃO (SOELÉTRICA oracao co pi + orbemo pra [ L- Figura 4 Segiiência de eventos na separação de dois solutos pelos quatro modos da eletroforese. Na eletroforese por fronteira móvel, uma quantidade apreci- ável de amostra é colocada em um tubo, preenchido com solu- ção tampão. Após o estabelecimento do campo elétrico, os componentes da amostra migram em uma dada direção, e com uma velocidade característica, dependente da mobilidade do componente. A separação completa de todos os componentes da amostra nunca é atingida. Apenas os componentes de maior mobilidade podem ser parcialmente purificados, enquanto que as outras bandas sofrem diversos graus de sobreposição. A eletroforese de zona, em princípio, é também uma técnica de fronteira móvel, em que a amostra é introduzida no meio tamponado, como uma banda de pequena espessura. Quando o potencial é aplicado, cada zona migra independentemente, com velocidade constante mas diferenciada, característica de sua própria mobilidade. As modalidades da eletroforese em solu- ção livre, gel e micelar pertencem a essa categoria. QUÍMICA NOVA, 19(2) (1996) Em isotacoforese, a amostra é inserida entre duas solt- ções, o eletrólito “líder” e o eletrólito “terminador”, Ambos, cátions e ânions, podem ser analisados por este modo, en- tretanto em misturas distintas. A figura 1 ilustra a separação isotacoforética de uma mistura de cátions. Neste exemplo particular, o eletrólito líder deve conter um cátion cuja mo- bilidade é maior que a mobilidade de qualquer componente catiônico da amostra. Por outro lado, o eletrólito terminador deve conter o cátion de menor mobilidade. Quando o campo elétrico é estabelecido, diferentes gradientes de potencial evolvem em cada banda, de tal forma que todos os cátions eventualmente migram com velocidade constante e única. Em regiões onde cátions de menor mobilidade estão presen- tes, o campo elétrico é mais intenso. Estes solutos, entretan- to, movem-se com a mesma velocidade que os solutos de maior mobilidade, estes últimos submetidos a campos elétri- cos mais fracos. Portanto, as velocidades das bandas indivi- duais são auto-normalizadas. A focalização isoelétrica envolve a separação de solutos anfotéricos em um gradiente de pH. Sob a influência do campo elétrico, um soluto negativamente carregado migra em direção ao anodo. Durante sua migração, o soluto experimenta regiões de pH progressivamente menor. Assim, uma fração cada vez maior do soluto torna-se protonada, e desta forma, a carga efe- tiva é alterada durante a migração. Eventualmente, a carga total do soluto torna-se zero, e sua migração é interrompida. Cada componente da amostra migra para uma região de pH igual ao seu ponto isoelétrico, e permanecerá nesta posição enquanto o campo elétrico for operante. A maior limitação para a rapidez, eficiência e aumento de escala de separações eletroforéticas é a falta de habilidade de dissipar calor, causado pela passagem de corrente através do meio condutor (efeito Joule). O calor, gerado uniformemente através do meio condutor, é dissipado somente pelas extremi- dades do recipiente, gerando gradientes de temperatura. Gradi- entes de temperatura induzem gradientes de densidade, que por sua vez podem causar convecção. Fluxos convectivos servem para misturar bandas já separadas. Outro fator desfavorável, decorrente do efeito Joule, é a introdução de uma dependência espacial para a mobilidade dos solutos. As moléculas localiza- das na região central do meio de separação irão migrar mais rapidamente que as moléculas localizadas nas bordas, causan- do dispersão da zona. Adicionalmente, se a temperatura do meio se torna muito alta, pode haver um comprometimento da integridade estrutural da amostra, +73 Tradicionalmente, para contrabalançar os distúrbios causa- dos pelo efeito Joute são empregados suportes sólidos, tal como papel, amido, agarose, acetato de celulose e géis de poliacrila- mida. Esta prática, no entanto, tem o incoveniente de aumentar a área disponível para adsorção do soluto, o que pode causar sérias distorções da banda. Além disso, a preparação e tingi- mento de géis, como prática, requer uma manipulação intensi- va que, frequentemente, pode levar a resultados analíticos de baixa qualidade. Apesar dos suportes anti-convectivos aumen- tarem a eficácia na remoção do calor, o campo elétrico é limi- tado a um intervalo pequeno (10 - 50 Vicm). Uma solução simples para o problema do efeito Joule em eletroforese é a utilização de tubos com dimensões capilares (15 - 100 um). A geometria do capilar (elevada área superfici- al interna relativa ao volume) favorece a dissipação de calor. A remoção eficiente do calor através das paredes do capilar, praticamente elimina a convecção, sendo possível o estabeleci- mento de campos elétricos substancialmente maiores, i.e. 100 - 500 V/cm. Nestas condições, as bandas se aproximam do limi- te teórico, de serem alargadas apenas por difusão longitudinal. Em casos favoráveis, aproximadamente um milhão de pratos podem ser obtidos, fazendo da eletroforese capilar a técnica eletroforética de maior eficiência. A eletroforese capilar oferece outras vantagens sobre os métodos eletroforéticos convencionais, como o manuseio de volumes bastante reduzidos (1 - 10 nL) de amostra, e a com- pleta automação da análise, com possibilidade de injeção e detecção em fluxo. Outra vantagem é à compatibilidade com uma variedade de sistemas de detecção disponíveis para cro- matografia líquida, como absorção no UV-VIS, fluorescência, métodos eletroquímicos, condutividade, e espectrometria de massas, entre outros, que fazem da eletroforese capilar uma técnica muito mais sensível e reprodutível que os métodos eletroforéticos empregando géis. Historicamente, a eletroforese foi introduzida por Tiselius,* no início da década de 30, através do elegante método da frontei ra móvel, descrito anteriormente (figura 1). Por este trabalho pi oneiro, no qual a separação parcial de algumas proteínas constitu- intes do soro sangifneo é demonstrada, foi concedido a Tiselius o prêmio Nobel de 1948. Desde então, a eletroforese tem ocupado uma posição única entre as metodologias empregadas para bio- moléculas. Mas foi somente na última década, com a implemen- tação das técnicas capilares, que a eletroforese evolveu de um formato de manipulação intensiva para um formato totalmente automatizado, ganhando o status de técnica analítica de rotina. A primeira demonstração do uso de campos elétricos eleva- dos em eletroforese data de 1967, e é atribuída a Hjérten, que empregou um tubo de quartzo, em rotação, com dimensões de 300 um de diâmetro e 36 cm de compcimento, e voltagens de 2,5 a 3 kV (aproximadamente 75 V/cm). Em 1974, Pretorius et al.$ demonstraram o efeito de bombeio do fluxo eletroosmó- tico, salientando as vantagens deste modo, em comparação aos métodos tradicionais de bombeio de fase móvel em cromato- gratia. Nessa mesma época, Virtanen” advogava as vantagens do uso de tubos de pequeno diâmetro (50 - 200 um) para sepa- rações eletroforéticas, Essa tendência em breve iria culminar em 1979, com a primeira demonstração da eletroforese de zona em tubos de teflon de pequeno bore (200 um de diâmetro), na Holanda, pelo grupo de Everaerts.” Neste trabalho, conseguiu-se a separação de uma mistura de 16 ânions, com pratos de 10 um, em aproximadamente 10 minutos. Durante o começo da década de 80, nos Estados Unidos, Jorgenson e colaboradores,”!º além de uma série de outros grupos de pesquisa, liderados por Ewing, Zare e Yeung, 13 contribuíram significativamente para o crescimento inicial da eletroforese capilar, investigando a viabilidade de seu uso, como técnica analítica instrumental. Cabe ainda salientar as contribuições de Karger e colaboradores, '*!$ que lograram a introdução e desenvolvimento da eletroforese capilar em gel, A 174 estendendo a técnica a macromoléculas, através da inclusão de uma dependência do tamanho da molécula no mecanismo de separação. Relevantes também foram as contribuições de Terabe é colaboradores, 'é que introduziram uma versão modi- ficada de eletroforese capilar, à eletrocromatografia micelar. Nessa modalidade, micelas são introduzidas na solução tam- pão, fornecendo um sistema cromatogrático de duas fases para a separação de moléculas neutras. Nos últimos quinze anos, a eletroforese capilar tem conguis- tado a atenção da comunidade científica internacional, como uma poderosa técnica alternativa para a separação e análise de com- postos de interesse industrial, farmacêutico, clínico, e ambiental. A bibliografia da eletroforese capilar conta com vários livros didáticos," e artigos de revisão, 252º abrangendo os aspeo- tos teóricos da técnica e compitando suas inúmeras aplicações. INSTRUMENTAÇÃO Um aspecto bastante importante da eletroforese capilar é a simplicidade da instrumentação, Um diagrama de blocos, mos- trando os componentes de um sistema para implementar a eletroforese capilar, é esquematizado na figura 2. O sistema consiste de uma fonte de alta tensão, capilares (sílica fundida é o material mais comumente empregado), eletrodos (geral- mente platina), e um detector apropriado. Uma fonte cc regu- lada, de alta tensão, é usada para estabelecer um campo elétri- co ao longo do capilar. Tais fontes podem, em geral, ser ope- radas à voltagem constante e/ou corrente constante, com valo- res típicos de voltagem no intervato de O - 50 KV e corrente, de 0 - 200 LA, O operador é protegido contra um contato aci- dental com a alta voltagem pela inclusão do sistema inteiro, ou pelo menos o terminal de alta voltagem, numa caixa de acríli- co, equipada com chaves de segurança. A fonte de alta tensão é conectada, através de eletrodos de platina, a dois reservató- rios contendo uma solução de um eletrólito conveniente. Tu- bos capilares de sílica fundida são então preenchidos com a solução, e servem como canal de migração. As extremidades do capilar são imersas nos reservatórios da solução para com- pletar o contato elétrico, Para minimizar efeitos térmicos, o capilar deve ser mantido à temperatura constante. Há várias possibilidades para termostatização do sistema, incluindo cir- culação de um líquido ou ar através de um cartucho contendo o capilar, além do use de ventiladores, e fornos. DISPOSITIVO PARA CAIXA DE TEMPERATURA hestuco N 5 cartas FONTE DE ALTA TENSÃO | OETECTOR ELETRODO HI | l T PESERVATÓRIO PARA SOLUÇÃO Figura 2. Instrumentação para eletroforese capilar. Introdução de Amostra. A maneira pela qual a amostra é introduzida no capilar tem implicação direta em análise quantitativa. A reprodutibilidade da área do pico, ou altura, reflete à precisão da técnica de injeção. Em eletroforese capilar, amostras podem ser introdu- zidas no capilar por métodos eletrocinéticos ou hidrodinâmicos. Na injeção eletrocinética, um gradiente de potencial é estabe- lecido ao longo do comprimento do capilar por um período de tempo conhecido, enquanto que na injeção hidrodinâmica uti- liza-se um gradiente de pressão. O gradiente de pressão pode QUÍMICA NOVA, 19(2) (1998) é de fato uma soma das contribuições de todas as espécies iônicas i. Cada espécie contribui para a condutividade total de maneira proporcional a sua concentração Ci, magnitude da carga z;, e mobilidade |: k=FE (lu mw C) [Pa] onde F é a constante de Faraday. A mobilidade do íon corres- ponde a sua velocidade limite vi, em um campo elétrico de valor unitário: [e 6] E A velocidade é a distância percorrida pelo íon por unidade de tempo: u=b 14) t A intensidade do campo elétrico é expressa pelo valor má- ximo do gradiente de potencial por unidade de comprimento: E=Y 65] L Voltagem e corrente estão relacionadas pela lei de Ohm (V =R i), onde a resistência R é o inverso da condutância G (equação [1]). A figura 3 representa, esquematicamente, a migração de um fon e sua esfera iônica, sob a influência de um campo elétrico. Inicialmente, o fon é acelerado até que forças de atrito, entre outras (retardamento e relaxação), contrabalançam a força elétri- ca. Um estado estacionário é atingido, onde o íon continua sua trajetória em movimento constante, com a velocidade final ad- quirida, A força elétrica é dada por um produto envolvendo a carga do íon, z;, a carga elementar, e, e o campo elétrico: Fama =; = [nl e E [6] A força de atrito pode ser aproximada pela lei de Stokes, para íons de forma esférica como: Paio = =67N6 vi [4] onde 1 é a viscosidade do meio e r; é o raio iônico efetivo. As forças de retardamento (F;) e relaxação (F4) estão associadas à presença da esfera iônica e, portanto, são mais difíceis de quantificar. O retardamento aparece porque a esfera iônica possui carga oposta à do fon e, consegilentemente, tende à Figura 3.Forças atuantes em um fon e sua esfera iônica durante mi- grução eletroforética: força elétrica (Fi), força de atrito (Fa), força de retardamento (Fs), é força de reluxação (Fé). 176 migrar em direção oposta. A relaxação se relaciona à tendência da esfera iônica em se redistribuir simetricamente ao redor do fon. Entretanto, como o fon está em movimento constante, existe um tempo finito para a esfera iônica se rearranjar. O resultado é um alongamento da esfera iônica em relação à posição central do íon. Quando o íon atinge a velocidade final, a resultante de for- ças é nula, e as equações [6] e [7] se equivalem: lglee=67n 6 w [8] Para efeito de simplificação, a contribuição das forças de retardamento c relaxação ao movimento final do fon será igno- rada. Assim, a mobilidade iônica pode ser aproximada pela combinação das equações [3] e [8]: olale 9] 6ann O Conceito de Mobilidade Efetiva. Para soluções de eletrólitos compostos de um ácido ou base fracos, existem pelo menos duas espécies em equilíbrio, a molé- eula não ionizada (com mobilidade zero), e a base ou ácido con- jugado, cada qual com um valor particular de mobilidade. Assim, da mesma forma que os íons simples são caracterizados por um valor de mobilidade iônica (fu), o conceito de mobilidade efetiva é utilizado para descrever a migração de eletrólitos fracos. A mo- bilidade efetiva (gor) pode ser calculada pela definição clássica de Tiselius, na qual qualquer substância i presente em solução em diferentes formas j, relacionadas entre si por um equilíbrio ácido- base rápido, irá migrar em um campo elétrico como um soluto único, possuindo uma certa mobilidade efetiva dada por: (Hed: = E (py a) 10] onde q; é a fração molar ou função de distribuição, e |; a mobilidade iônica de cada espécie individual j. As funções de distribuição dependem da magnitude das cons- tantes de dissociação do soluto (pK,), é determinam a predomi- nância relativa das várias espécies num intervalo de pH. Desta forma, a equação [10] sugere uma dependência indireta entre à mobilidade efetiva e o pH do meio. A figura 4 apresenta curvas de mobilidade efetiva versus pH para alguns solutos de interesse geral (dados de pK, e mobilidade individual das espécies foram obtidos da compilação de Hirokawa et al.).” Curvas desse tipo são excelentes indicadores da condição de pH mais propícia para a separação ocorrer, ou seja, o pH onde as diferenças entre as mobilidades efetivas dos solutos são maximizadas. ': 2 a y Eq Figura 4, Mobilidade efetiva em função do pH para os compostos: ácido oxálico (4), ácido acético (0), fenol (A), aspirina (BO, ácido carbônico (4), ácido mulêico (DJe ácido nicotínico (o QUÍMICA NOVA, 1942) (1896) Teoria da Migração Eletroosmótica Interface Solução - Capilar. Entre os vários materiais utilizados na fabricação de capila- res, a sílica fundida, uma forma pura de dióxido de silício amorfo, tem encontrado maior uso. Este material confere aos capilares muitas propriedades interessantes, como dimensões precisas, alta constante dielétrica, baixa condutividade elétrica, alta condutividade térmica, resistência mecânica, maleabilidade, resistência ao ataque químico e, particularmente, alta transmi- tância óptica para um intervalo apreciável de comprimento de onda (190 a 900 nm). No entanto, o uso de capilares de sílica é também responsável por um importante fenômeno em eletro- forese capilar: o fluxo eletroosmótico. Quimicamente, a sílica fundida é caracterizada pela presen- ça de vários tipos de grupos silanol (figura 5), os quais, em média, apresentam um caráter ácido. Em contato com o meio aquoso, alguns desses grupos são ionizados e, com a ioniza- ção, a superfície do capilar se torna negativamente carregada. Outra possibilidade para a presença de carga na superfície do capilar é a adsorção de espécies iônicas. Em ambos os casos, o resultado é o mesmo: surge na solução em proximidade à superfície, uma distribuição espacial não-homogênea de carga, conhecida como dupla camada elétrica." |-s-oH siLANOL 4 AS S—o)-8-a, ho HW Silanóis vicinais No A s—d—s- (ponte de hidrogênio) q 7 a o H si— dO si= 0" silanol dissociado pi s, si— os, RA O: SILOXAN a da? º 4 fo: N s— 45 Si-OH | silanoi isolado / | N em | A N silandis geminais SUPERFÍCIE Figura 5. Representação esquemática da estrutura química da super- Jície de um cupilar de sílica fundida. O modelo combinado de Gouy-Chapman-Stern-Grahame (figura 6) descreve a região imediatamente adjacente à super- fície como ocupada por camadas de moléculas de água orien- tadas e alguns íons, provavelmente desidratados, os quais são fortemente atraídos pela superfície por forças eletrostáticas e/ ou de coesão (adsorção específica). O centro destes fons define um plano, conhecido como o plano interno de Helmholtz (IHP). Íons hidratados se aproximam da superfície a uma distância correspondente ao seus raios de hidratação. Estes íons são mais fracamente ligados à superfície, e a interação é dependente das propriedades químicas dos íons (adsorção não-específica), O plano definido pelo centro dos íons hidratados é conhecido como o plano externo de Helmhottz (OHP), ou camada de Stem, e delimita a camada compacia da dupla camada elétrica. Devido a um movimento térmico randômico, alguns íons difundem, se afastando da superfície, A concentração de fons de carga oposta à superfície decresce com a distância e, eventualmente, aproxima- se do valor da concentração dos tons na solução. Esta região é conhecida como a camada difusa da dupla camada elétrica. QUÍMICA NOVA, 1942) (1996) SUPERFÍCIE & soLUÇão CAMADA COMPAGTA CAMADA DIFUSA Figura 6. Modelo para a interface capilarisolução. Quando um campo elétrico é imposto tangencialmente à super fície, forças elétricas atuam nas cargas da camada difusa, cau- sando um movimento unilateral de fons em direção ao eletrodo de carga oposta. Durante a migração, os íons transportam molé- culas de água, induzindo um fluxo de solução como um todo, conhecido como fluxo eletroosmótico. A distância na qual uma fração da camada difusa consegue escapar às forças de atração da superfície é caracterizada como o plano de cisalhamento. Este plano delimita a parte imóvel da região difusa da dupla camada elétrica. O potencial desenvolvido no plano de cisalhamento é conhecido como o potencial eletrocinético ou potencial zeta, Q. Sua magnitude tem implicações bastante importantes no desen- volvimento e caracterização do fluxo eletroosmótico. A distribuição do potencial na dupla camada elétrica pode ser derivada, resolvendo-se a equação de Poisson-Boltzmann para casos limite!2, Se o potencial na superfície (Wo) é suficiente- mente pequeno (< 50 mV), o perfil de potencia) com a distância (x) pode ser aproximado conforme a teoria de Debye-Hiickel: W=Vo exp(-Kx) nm Um dos parâmetros mais importantes que emergem desta teoria é o parâmetro x, o qual correlaciona propriedades da solução com a dimensão da dupia camada elétrica: 18-10 Na 7 (52M,) [E] EXT onde z; é a carga e M; a molaridade do íon à, € é a constante dielétrica do meio, e é a carga elementar, NA é o número de Avogadro, £é a constante de Boltzman e T é a temperatura absoluta. A quantidade x “*, conhecida como o comprimento de Debye, é fregientemente usada para caracterizar a espessu- ra da dupla camada elétrica. Fluxo Eletroosmótico. Os princípios que hoje são usados para relacionar as propri- edades da solução com a magnitude do fluxo eletroosmótico foram introduzidos no princípio do século, no contexto da química de colóides.! Para entender o desenvolvimento do flu- xo eletroosmótico é preciso examinar as forças que atuam na proximidade da superfície do capilar, quando um campo elétri- co tangencial é estabelecido (figura 7). Para tanto, a solução dentro do capilar é dividida em camadas concêntricas; cada camada possui uma distribuição de íons do tipo Boltzman, e espessura infinitesimal (dx). As forças atuantes são de natureza elétrica e de atrito. A força elétrica atua em todos os fons presentes no segmento da solução, sendo proporcional à magnitude do campo elétrico e à densidade da solução (p): Feia = Fr =Ep dx [EE] 17 A figura 9 apresenta o efeito do pH e concentração na magnitude do fluxo eletroosmótico para soluções tamponadas de fostato de sódio). Essas curvas podem, de fato, ser inter- pretadas como curvas de titulação da superfície. Desta forma, o potencial zeta é, portanto, a velocidade eletroosmótica (equa- ções [22] e [23]). são bastante elevados em meio básico, de- crescem rapidamente entre pH 8 e 4 e, praticamente, estabili- zam em meio ácido. As curvas sigmoidais apresentam um pon- to de inflexão único, correspondente ao pK, médio dos vários grupos silanol da superfície (pK, 5,9). Outra característica inte- ressante dessas curvas é a indicação do ponto de carga zero (PZC), que para sílica gel é sabido ocorrer a pH 2,5. Quando o pH da solução atinge o ponto de carga zero, há um colapso da dupla camada elétrica e o fluxo eletrosmótico deixa de existir. Outra forma efetiva de alterar, ou mesmo inibir o fluxo cle- troosmótico, consiste em modificar a composição química do material do capilar e, portanto, a densidade de carga superficial. Além de sílica fundida, outros materiais têm sido testados, como vidro e teflon, Outra possibilidade consiste em alterar a natureza da superfície interna do capilar, através de revestimentos físicos efou métodos de derivatização química. E, finalmente, a aplica- ção de um campo elétrico externo, transversal ao capilar, é a maneira mais elegante de manipular o fluxo eletroosmótico. o ao so POTENCIAL ZETA, mv Figura 9, Variação do potencial zeta em junção do pH de soluções tamponadas de fosfato contendo cloreto de sódio, Concentração total de sódio: 5 (curva inferior) a 15 mM (curva superior), inere- mento de 2,5 mM. Equações Fundamentais Resolução e Eficiência. Em qualquer problema analítico envolvendo separação, o objetivo fundamental é o de atingir completa resolução entre todos os componentes da mistura. A resolução entre as bandas de dois solutos adjacentes é definida pela diferença entre o tempo de migração (1), dividida pelo valor médio entre as lar- guras de base de cada banda (ws), expressas nas mesmas uni- dades dos tempos de migração: 2(G+1-t) Wei + Wbir1 Rsjj+ a] Na presença de fluxo eletroosmótico, o tempo de migração do soluto i, do ponto de injeção até a posição do detector (La). é determinada por sua velocidade aparente de migração (vi), que é a combinação vetorial da velocidade eletroosmótica (Yosm) é eletroforética (vep), de acordo com: Lou Ley (asm + Eloy V us Vosm +Vep QUÍMICA NOVA, 19(2) (1998) onde Hom € Hop São as mobilidades eletroosmótica e eletrofo- rética, respectivamente, V é o potencial aplicado e Ly é O comprimento total do capilar. A figura 10 ilustra a separação de alguns solutos com aproximadamente o mesmo tamanho, mas cargas distintas, na situação de velocidade eletroosmótica maior, em magnitude, que a velocidade eletroforética de qual- quer um dos solutos presentes. Na prática, esta situação é conseguida quando o eletrólito é uma solução de pH elevado e baixa concentração. Note que o detector é fixo em uma posi- ção conveniente, perto do final do capilar. O soluto catiônico migra com uma velocidade maior que a que migraria na ausên- cia de fluxo, e portanto chega ao detector em um tempo me- nor. O soluto neutro (velocidade eletroforética nula) migra exclusivamente pela ação do fluxo eletroosmótico. Se a amos- tra contém vários solutos neutros, com tamanhos aproximada- mente iguais, estes passariam pelo detector no mesmo tempo, como uma banda única, não resolvida. O soluto aniônico é ar- rastado pelo fluxo eletroosmótico para o polo de carga similar, e migra com uma velocidade menor que a do soluto neutro. À DETECÇÃO «—<& « EEE Pao Figura 10. Separação de solutos de tamanho similar e cargas distin- tas por eletroforese capilar de zona em solução livre. Deialhé mos- trando a superfície interna do capilar, carregada negativamente, e a organização da solução nas imediações da superfície. À composição vetorial das velocidudes eletrowsmáótica (vosn) é eletroforética (vep) resulia na velocidade aparente (vi) de migração do soluo. É importante observar que medidas experimentais do tempo de migração sempre levam à determinação de mobilidades apa- rentes. A mobilidade eletroosmótica precisa ser determinada separadamente, para que a mobilidade eletroforética do soluto possa ser avaliada. O tempo de migração de uma molécula neutra, como indicativo da velocidade eletroosmótica, consti- tuí um dos métodos mais simples, Há ainda a possibilidade de usar moléculas neutras como padrões internos e fazer medidas relativas de tempo de migração do soluto em investigação em relação à mólecula neutra. Neste caso, irregularidades introdu- zidas pela injeção da amostra ou flutuações de voltagem/cor- rente durante operação podem ser contornadas. Mesmo as alte- rações do fluxo eletroosmótico, em decorrência de modifica- ções da superfície interna do capilar devido ao uso intensivo, são corrigidas com este procedimento. Para uma banda normalmente distribuída (Gaussiana), a lar- gura da base é relacionada com o desvio padrão da distribui- ção temporal (T): wWi=4T [26] onde 1 é expresso em unidades de tempo é sé relaciona ao desvio padrão da distribuição espacial (6), através da velocida- de da zona: t=8 w - A eficiência de uma separação está diretamente relacionada à variância da zona (0?) e pode ser expressa em termos do número de pratos (NJ): 2n 179 2 N=Lã [28] Cod ou pela altura equivalente a um prato (H): H=L& 29 O número de pratos pode ser calculado diretamente de um eletroferograma através da expressão: N=l6 (ij =5,54 (ij 130] onde wy é a largura da banda, tomada a meia altura, nas mes- mas unidades de tj. A variância da distribuição espacial (0?) é causada por vá- rios fenômenos dispersivos que ocorrem durante a permanên- cia do soluto no capilar. Se estes processos são independentes, então as variâncias são estatisticamente aditivas: d=1e, gu onde 2, representa a contribuição individual do processo de dispersão (n) à variância final observada. Mecanismos de Dispersão * Em eletroforese capilar são vários os fatores que contribuem para o alargamento das bandas. Entre os mais relevantes estão a difusão longitudinal, e os volumes finitos de injeção e detecção. Alguns fatores adicionais de variância incluem os gradientes de temperatura induzidos pelo efeito Joule, as interações soluto/ capilar, e as diferenças de condutividade entre a solução é à amostra, além de outros. A variância resultante da difusão longitudinal (0%) é dada pela expressão de Einstein: Sa = 2 Dt [32] onde D; é o coeficiente de difusão do soluto i. Em geral, os coeficientes de difusão de solutos de baixa massa molecular, em meio aquoso, são da ordem de 10º em?/s. É interessante relembrar que a difusão na direção radial do capilar não con- tribui para o alargamento das zonas, devido ao perfil caracte- rístico da velocidade eletroosmótica (vide figura 8). A variân- cia introduzida pela difusão longitudinal é uma função do tem- po de residência do soluto no capilar e, portanto, não depende somente das características do soluto, mas também da mobili- dade eletroosmótica e de outros parâmetros instrumentais. Ao substituir o tempo de migração da equação [32] pela equação [25], esta dependência se torna explícita: ctg = 2Di Loo Lay [3] (oem + Mep) A contribuição à variância da zona causada pela injeção de um volume finito de amostra, pode ser aproximada pela expressão introduzida por Sternberg, para uma zona de perfil retangular: 34] Para avaliar o comprimento inicial da zona de amostra injetada no capilar (qu), O modo de injeção precisa ser considerado. Na introdução hidrodinâmica de amostra, um gradiente de pressão é 180 estabelecido no capilar, por um breve período. Sob condições de fluxo laminar, o comprimento da zona é então determinado pela equação de Hagen-Poiseuille: 5] onde tj É O tempo de injeção, 1 é a viscosidade da solução e AP é a diferença de pressão estabelecida entre as extremidades do capilar. Quando a injeção hidrodinâmica é feita por aplicação de pressão na entrada do capilar, ou vácuo na saída do capilar, a diferença de pressão é conhecida. Quando a injeção é feita através de sifonagem, a diferença de pressão pode ser calculada por: AP=pgáh 6] onde Ah é a diferença de altura entre o nível de solução nos dois reservatórios, p é a densidade da solução e g é a acelera- ção da gravidade. A dispersão causada pelo perfil parabólico de velocidade, característico do fluxo induzido por pressão, não está sendo considerada no cômputo do comprimento da zona pela equação [35]. Na introdução eletrocinética de amostra, um gradiente de potencial é estabelecido no capilar, por um breve período. O comprimento da zona injetada é determinado peta mobilidade aparente do componente de maior mobilidade na amostra e do tempo de injeção: Go ee = (Mom to tigj 7 É importante que o comprimento da amostra injetada no capilar seja minimizado. Idealmente, o comprimento deve ser menor que o desvio padrão causado por difusão longitudinal, (Y 2 Dt). O comprimento exato depende do coeficiente de difusão do soluto e do tempo de análise. Macromoléculas po- dem apresentar coeficientes de difusão até 100 vezes menores que solutos de baixa massa molecular e, portanto, necessitam comprimentos de injeção menores. Em qualquer detector, um volume finito de solução está sempre em contato com o transdutor, e o sinal de saída repre- senta uma resposta média. Se o transdutor tem um limite espa- cial distinto e resposta uniforme no sentido de seu comprimen- to, à distribuição da zona apresenta um perfil retangular e a variância pode ser aproximada pela expressão de Sternberg: 2 pda [28] 12 onde 4je, É o comprimento da janela no detector, ou o compri- mento do capilar exposto ao sistema detector. CONCLUSÃO A eletroforese capilar constitui uma técnica moderna de separação, com ampla aceitação no âmbito acadêmico e indus- trial, que tem mostrado um surpreendente desenvolvimento nos últimos dez anos. No Brasil, esta técnica é ainda muito pouco difundida, apesar da excelência de seu desempenho analítico, da diversidade de suas aplicações e da simplicidade e relativa- mente baixo custo do instrumental necessário. O presente tra- balho procurou introduzir um texto básico sobre a eletroforese capilar, ressaltando os fundamentos teóricos da migração ele- troforética e eletroosmótica, e descrevendo os parâmetros ins- trumentais que influenciam a qualidade da separação. AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer ao CNPq (bolsa de recém-doutor) e FAPESP peio auxílio concedido para à construção de um equipamento de eletroforese capilar com detectores Raman e QUÍMICA NOVA, 1942) (1998) 
