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Eletroforese, Manuais, Projetos, Pesquisas de Química
Explicação da eletroforese; Creditos ao Centro de Pesquisa René Rachou.
Tipologia: Manuais, Projetos, Pesquisas
Antes de 2010
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Eletroforese
Eletroforese –para separar e às vezes purificar macromoléculas –proteínas e ácidos nucléicos – diferentes tamanhos, carga ouconformaçãoQuando moléculas são colocadas em um campo elétrico, migrampara o pólo positivo ou negativo.
Proteínas (carga líquida negativa ou
positiva) e DNA sempre negativa (fosfato) Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel O gel é submerso em um tampão que possui íons para a corrente passarE também para manter o pH mais ou menos constante.
Gel: composto de agarose ou poliacrilamidaAgarose
é um polissacarídeo extraído de alga marinha. Usada em concentrações de 0,5 to 2%. Fácil de preparar.Não-tóxico. Géis de Agarose possuem ampla capacidade de separaçãomas baixa resolução Dependendo da concentração podem separar fragmentos deDNA de 200 a 50.000 bp, via eletroforese.
Poliacrilamida
é um polímero de ligação cruzada de acrilamida. Comprimento
das cadeias do polímero dependem da concentração usada (3,5 a 20%).São mais difíceis de preparar. Como oxigênio inibe a polimerização precisamser montados entre placas de vidro. Acrilamida: potente neurotóxico e deve ser manipulado com cuidado!!! Luvas e máscaras devem ser usadas para pesar o pó. A poliacrilamida éconsiderada não tóxica mas luvas devem ser usadas pela possível presençade acrilamida livre Géis de poliacrilamida possuem baixa capacidade de separação masalta capacidade de resolução.
Para DNA a poliacrilamida é usada para
separar fragmentos de menos de 500 bp. Às vezes podem ser separadosfragmentos com tamanho de apenas uma base de diferença. Também usadospara separação de proteínas.
Tampão de amostra
SYBR Green > Molecular Probes 1995 > Revolucionou a detecção de DNA em géis A intensidade da fluorescência do SYBRGreen é aumentada em 100X quando seliga ao DNA. Consegue-se ver picogramasde DNA.^ Junto a sua sensibilidade superior o SYBRGreen tem outras vantagens sobre o EtBr:- É muito menos mutagênico,- Pode ser adicionado diretamente àamostra antes da eletroforese.
Eletroforese Vertical
VISUALIZAÇÃO APÓS SDS-PAGE^ Coomassie Blue
Coomassie Brilliant Blue R250,se liga inespecificamente apraticamente todas asproteínas. É menos sensívelque corar com a prata masefetivo também, além de serfácil de corar.
http://www.theses.ulaval.ca/2005/22772/22772049.jpg