Baixe Eletroquímica em Eletroforese Capilar: Resistência Elétrica e Fluxo Eletroosmótico e outras Manuais, Projetos, Pesquisas em PDF para Química, somente na Docsity!
MECANISMOS DE SEPARAÇÃO EM ELETROFORESE CAPILAR
Marina F. M. Tavares Instituto de Química - Universidade de São Paulo - CP 26077 - 05599-970 São Paulo - SP
Recebido em 6/11/96; aceito em 14/4/
SEPARATION MECHANISMS IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS. Since its inception in the 80’s, capillary electrophoresis has matured into a well established technique for the separation and analysis of complex samples. One of its strongest aspects is the ability to handle materials from a diversity of chemical classes, ranging from few to millions of Daltons. This is only possible because several modes of electrophoresis can be performed in a single capillary format. In this work, relevant aspects of capillary zone electrophoresis in its three modes (free solution, micellar and gel), capillary isoelectric focusing and capillary isotachophoresis are discussed and many representative applications are presented.
Keywords: free solution capillary electrophoresis; micellar electrokinetic capillary chromatography; capillary electrochromatography; capillary gel electrophoresis; capillary isoelectric focusing; capillary isotachophoresis.
REVISÃO
INTRODUÇÃO
A ciência das separações, em termos de instrumentação ana- lítica, contemplou nas últimas décadas grandes avanços tecnológicos: a década de 50 foi caracterizada pela introdução da cromatografia em fase gasosa (GC), enquanto que a década de 70 testemunhou o desenvolvimento da cromatografia em fase líquida (HPLC). Os anos 80, mais precisamente os últi- mos dez anos, foram marcados pela implementação da terceira grande técnica instrumental de separação, a eletroforese capi- lar 1-8^. O rápido avanço da eletroforese capilar decorre, em par- te, da simplicidade instrumental, mas principalmente da varie- dade dos modos de separação que podem ser efetuados em uma única coluna capilar 9 e da diversidade dos compostos passíveis de análise em cada modo 10. Na eletroforese capilar, a separação é conduzida em tubos com dimensões de 15 a 100 μm de diâmetro interno, e 50 a 100 cm de comprimento, preenchidos com um eletrólito con- dutor, e submetidos à ação de um campo elétrico. O uso do capilar oferece muitas vantagens sobre os outros meios utiliza- dos para eletroforese (placas de gel, papel, etc). Devido a fa- tores geométricos (a relação entre a área superficial interna e volume é apreciavelmente grande), um capilar possibilita a dissipação eficiente do calor, gerado pela passagem da corren- te elétrica (efeito Joule). Além disto, a alta resistência elétrica do capilar permite o estabelecimento de campos elétricos ele- vados (100 a 500 V/cm), resultando em separações de alta efi- ciência (geralmente excede 10 5 pratos teóricos), resolução inigualável e tempos de análise apreciavelmente curtos. Outras vantagens da eletroforese capilar são: pequena demanda de amostra, com volumes tipicamente da ordem de 1 a 10 nL, e a possibilidade de injeção e detecção em fluxo. Além da migração eletroforética dos íons, outro fenômeno de migração ocorre, a eletroosmose, ou seja, fluxo de solução induzido pelo campo elétrico, o qual confere à técnica parte de suas características de alta eficiência 11. Dentro do tubo capilar, o fluxo eletroosmótico é caracterizado por um perfil radial constante da velocidade, não contribuindo, portanto, para o alargamento das bandas. Esta peculiaridade distingue eletrofo- rese capilar dos métodos cromatográficos em fase líquida, que apresentam um variação parabólica para o perfil radial da velo- cidade dentro da coluna, característico do fluxo induzido por pressão. Além disto, o fluxo eletroosmótico, em geral de grande
magnitude, é responsável pela condução dos solutos, sem dis- tinção de carga, na direção do detector, permitindo assim a análise simultânea de amostras contendo solutos catiônicos, neutros e aniônicos. Em artigo de divulgação anterior 1 , a eletroforese capilar foi apresentada sob uma perspectiva histórica, sendo exami- nados os conceitos fundamentais sobre a migração eletroforé- tica e eletroosmótica, além de aspectos instrumentais referen- tes à introdução de amostras e detecção. No presente traba- lho, procura-se descrever, em maior detalhe, a eletroforese capilar de zona nos seus vários modos de separação (solução livre, micelar e gel), assim como a focalização isoelétrica capilar e a isotacoforese capilar, apresentando algumas de suas aplicações mais representativas.
I. ELETROFORESE DE ZONA
I.1. Eletroforese Capilar em Solução Livre
A eletroforese capilar em solução livre ( free solution capillary electrophoresis , FSCE ou capillary zone electropho- resis , CZE, como é ainda comumente conhecida) é um dos modos de separação eletroforética mais usados na prática, pro- vavelmente em razão da facilidade de sua implementação e otimização das condições experimentais 12,13^. Em FSCE, o tubo capilar é simplesmente preenchido com um eletrólito, geral- mente com características tamponantes. A separação ocorre como resultado de duas estratégias: maximizar as diferenças entre as mobilidades efetivas dos solutos e minimizar as cau- sas de alargamento das zonas. A equações tradicionais que descrevem resolução, eficiên- cia e tempo de migração em FSCE incorporam o fenômeno de difusão como única causa de alargamento das zonas 1 , e podem ser escritas como:
Rsi , i + 1 =
( μ i −μ i + 1 )
V
D ( μ (^) média + μ osm )
(^12) (1)
N =
L det ( μ ef + μ osm ) V 2 D Ltot
t (^) i =
L det Ltot ( μ ef + μ osm ) V
onde μi e μi+1 são as mobilidades aparentes de dois solutos eluindo em posições adjacentes, μmédia é a mobilidade média dos solutos, μef é a mobilidade eletroforética do soluto i, μosm é a mobilidade do fluxo eletroosmótico, V é a diferença de potencial aplicada, D é a média dos coeficientes de difusão dos dois solutos, L (^) tot é o comprimento do capilar e L (^) det é a distância do ponto de injeção à posição do detector. As equações (1) a (3) indicam que o uso de voltagens eleva- das é vantajoso, pois implica em um ganho de resolução e efi- ciência, assim como na diminuição do tempo de análise. Outra observação pertinente é que, em separações difíceis, a resolução de pares de solutos eluindo muito próximos pode ser melhorada pelo ajuste da magnitude do fluxo eletroosmótico. Quando a mobilidade eletroosmótica for aproximadamente igual, mas de sinal oposto à mobilidade dos solutos, um ganho de resolução é alcançado (equação 1). As penalidades para este tipo de estraté- gia, no entanto, são: perda de eficiência (equação 2) e aumento considerável do tempo da análise (equação 3).
Soluções Tampão
Quando a separação envolve solutos com caráter ácido-base, a mobilidade eletroforética do soluto depende do pH do eletró- lito. Neste caso, o termo mobilidade efetiva, o qual incorpora o produto das mobilidades eletroforéticas das espécies em equi- líbrio e a distribuição das concentrações relativas de cada es- pécie no pH considerado, é empregado 1. Assim sendo, o con- trole do pH é aconselhável e a escolha de uma solução tampão adequada tem implicações diretas na otimização da separação. Adicionalmente, a suscetibilidade do fluxo eletroosmótico a variações de pH requer que o tampão apresente constância no valor de pH (alta capacidade). Outras propriedades desejáveis para um sistema tampão incluem: baixo valor de absorbância no comprimento de onda selecionado para a análise, e baixa mobilidade, para minimizar a geração de calor por efeito Joule. Além disso, a escolha do tampão está vinculada a considera- ções sobre a forma da banda: via de regra, tampões contendo íons com mobilidade semelhante à do soluto previnem distorções no perfil da banda e minimizam o seu alargamento.
De forma geral, os sistemas tampão são eficientes em um intervalo de pH correspondente ao pK (^) a , mais ou menos uma unidade. Na tabela 1 foram selecionados os tampões mais comumente usados em eletroforese capilar e seus respectivos pK (^) a. Especialmente úteis para eletroforese capilar são os tam- pões biológicos, conhecidos como tampões de Good (Tris/ borato, histidina, Caps, etc). Estes sistemas, em geral, possuem íons grandes, de baixa mobilidade e podem ser usados em altas concentrações, sem a desvantagem de gerar calor excessivo. Entretanto, os tampões de Good apresentam a inconveniência de absorver fortemente na região do UV. Em capilares de sílica fundida, o intervalo de pH adequa- do para trabalho varia entre 2 e 11, mas em geral este inter- valo é limitado pela estabilidade do soluto. A concentração das soluções tampões usadas em eletroforese capilar varia tipicamente entre 5 e 200 mmol L -1^. Na escolha da concentra- ção são considerados vários efeitos. Altas concentrações po- dem comprometer a separação, pelo excesso de calor decor- rente do efeito Joule. Baixas concentrações podem aumentar a tendência de adsorção de certos solutos na parede do capi- lar e, portanto, ocasionar alargamento e distorção das bandas. Adicionalmente, em baixas concentrações, o fluxo eletroos- mótico pode se tornar errático, o que dificulta a reprodutibilidade dos tempos de migração e conseqüentemen- te prejudica a identificação inequívoca dos solutos. A FSCE é aplicável a uma grande variedade de solutos, incluindo íons inorgânicos, compostos orgânicos de baixa mas- sa molecular e biomoléculas com alguns milhares de daltons. A figura 1 apresenta uma série de aplicações da eletroforese capilar em solução livre, em sistemas tamponados comuns. Um exemplo magistral do poder de resolução de FSCE é o apre- sentado na figura 1B. Nesta aplicação, a separação dos diaste- roisômeros de peptídeos sintéticos, contendo 36 aminoácidos, é demonstrada. Estes peptídeos foram sintetizados de tal forma que, dos 36 aminoácidos, 35 apresentam conformação L, e apenas um apresenta conformação D, a qual é inativa biologi- camente. A FSCE é capaz de distinguir tais isômeros, onde uma pequena alteração estrutural ocasiona a variação da distri- buição espacial de carga da molécula, e desta forma causa di- ferenças de mobilidade. Outro exemplo, que demonstra a esco- lha adequada do sistema tampão, é o apresentado na separação de açúcares da figura 1E. Além das características tamponantes,
Tabela 1. Sistemas tampão comumente usados em eletroforese capilar. 14
Sistema Tampão pK (^) a Sistema Tampão pK (^) a Sistema Tampão pK (^) a
Fosfato 2,12 Imidazol 7,00 HEPPSO 8, Citrato 3,06 MOPS 7,20 TRICINA 8, Formiato 3,75 Fosfato 7,21 Hidrocloreto de amido-glicina 8, Succinato 4,19 TES 7,50 Glicilglicina 8, Citrato 4,74 HEPES 7,55 TRIS 8, Acetato 4,75 BICINA 8, Citrato 5,40 Morfolina 8, Succinato 5,57 Borato 9, MES 6,15 CHES 9, ADA 6,60 CHAPSO 9, BIS-TRIS propano 6,80 CAPS 10, PIPES 6,80 Fosfato 12, ACES 6, MOPSO 6,
ACES: ácido 2-[(2-amino-2-oxoetil)amino] etanossulfônico; ADA: ácido N-[2-acetamido]-2-iminodiacético; BICINA: N,N-bis[2- hidroxietil)amino] etanossulfônico; BIS-TRIS: 1,3,-bis[tris(hidroximetil]-metilamino] propano; CAPS: ácido 3-[ciclohexilamino]- 1-propanossulfônico; CHAPSO: sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)-dimetilamônio]-2-hidroxi-1-propano; CHES: ácido 2-[N- ciclohexilamino] etanossulfônico; HEPES: ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-etanossulfônico; HEPPSO: ácido N-[2- hidroxietil]piperazina-N’-[2-hidroxi] propanossulfônico; MES: ácido 2-[N-morfolino] etanossulfônico; MOPS: ácido 3-[N-morfolino] propanossulfônico; MOPSO: ácido 3-[N-morfolino]-2-hidroxi propanossulfônico; PIPES: piperazina-N,N’-bis-[ácido etanossulfônico]; TES: ácido N-tris[hidroximetil]metil-2-amino etanossulfônico; TRICINA: N-[2-hidroximetil)etil]-glicina; TRIS: Tris(hidroximetil)amino metano.
o eletrólito escolhido, borato, possui propriedades complexantes e no caso, foi empregado para alterar a seletividade da separação.
Aditivos
Em FSCE é bastante comum o uso de eletrólitos aditivados. O uso de aditivos é indicado em quatro situações: para alterar a mobilidade do soluto, modificar o fluxo eletroosmótico, solubilizar solutos ou compostos na matriz da amostra e redu- zir a interação de certos solutos com a parede do capilar (minimizar adsorção). Uma lista de vários aditivos e seus res- pectivos efeitos é apresentada na tabela 2. Um dos exemplos mais interessantes da FSCE em eletrólitos aditivados é a separação de cátions inorgânicos. A separação de cátions é em geral uma prática difícil, em razão das semelhan- ças de raio iônico efetivo, que se refletem na similaridade da condutância equivalente e mobilidade. A figura 2 ilustra este problema, onde a condutância iônica equivalente de vários gru- pos de cátions é apresentada em ordem ascendente. Pela obser- vação dos valores, conclui-se que a separação dos metais alcali- nos e alcalinos terrosos é viável, enquanto que a separação de vários metais de transição é praticamente impossível. Neste caso, é então aconselhável a incorporação de agentes complexantes ao eletrólito de corrida (Figura 3A), visando uma alteração seletiva da mobilidade dos cátions e, conseqüentemente, um ganho de resolução. Outro recurso empregado na análise de cátions é o uso de um complexante auxiliar, como um composto de inser- ção, cuja cavidade discrimina solutos de diferentes tamanhos (Figura 3B). Em ambos os casos, como todas as espécies com- plexas e metal livre estão em equilíbrio dinâmico, o eletrofero- grama de um cátion metálico complexado apresenta uma banda única. O tempo de migração desta banda pode ser alterado, se o equilíbrio é deslocado, em razão da alteração da distribuição total de carga. Na prática, isto é feito pela modificação da con- centração do complexante no eletrólito 21. A análise de cátions é em geral realizada sob detecção espectrofotométrica indireta, uma vez que a maioria dos cátions metálicos apresenta baixa absortividade na região espectral de trabalho (200 a 900 nm). Assim sendo, a absorbância de um cromóforo catiônico (em geral um cloridrato de amina) é monitorada no decorrer da análise. Quando a banda do soluto catiônico chega ao detector, o cátion do cromóforo é desloca- do, e o sinal de absorbância decai, retornando a sua posição original, assim que o soluto deixa o detector. A figura 4 apre- senta dois exemplos clássicos de separação de cátions por FSCE
Tabela 2. Aditivos de eletrólito comumente empregados em eletroforese capilar.
Aditivo Função e/ou Efeito
Ácidos sulfônicos Agentes de pareamento iônico e modificadores da carga superficial.
Aminas Bloqueiam sítios ativos na superfície do capilar. Reduzem adsorção e assimetria de pico.
Anfólitos Reduzem a interação soluto-capilar, melhoram a resolução e simetria de pico.
Ciclodextrinas Usados nas separações quirais e como complexantes auxiliares na separação de compostos neutros.
Éter coroa Usados nas separações quirais e como complexantes auxiliares na separação de metais.
Glicóis Reduzem a adsorção soluto-capilar, auxiliam na solubilidade de solutos orgânicos e reduzem o fluxo eletroosmótico.
Metais de transição Modificam a mobilidade de certos solutos, afetam a resolução.
Polímeros de celulose Agentes modificadores do fluxo eletroosmótico.
Sais inorgânicos Reduzem o fluxo eletroosmótico, alteram a conformação de proteínas e previnem a adsorção soluto-capilar.
Solventes orgânicos Aumentam a solubilidade de solutos orgânicos. Reduzem interação soluto-capilar. Agentes modificadores do fluxo eletroosmótico.
Tensoativos catiônicos Revertem o fluxo eletroosmótico.
Uréia Aumenta a solubilidade das proteínas.
Figura 2. Condutância iônica equivalente dos metais do grupo I, II e transição (ref. 20, adaptado).
Figura 3. Representação esquemática da migração de cátions por ele- troforese capilar na presença de agentes complexantes (A) e compostos de inclusão (B). Detalhe mostrando a superfície interna do capilar, carregada negativamente, e a organização da solução nas imediações da superfície. A composição vetorial das velocidades eletroosmótica (v (^) osm ) e eletroforética (v (^) ef ) resulta na velocidade aparente (v (^) i ) de migra- ção do soluto.
em eletrólitos aditivados. O sinal do detector foi invertido, para que o eletroferograma apresente o seu registro convencional, com picos voltados para cima. Na figura 4A, além do cromóforo e do complexante, foi empregado o solvente metanol a 5%, cujo efeito provável é o de alterar o raio iônico efetivo de alguns cátions, melhorando a seletividade da separação. Na figura 4B, a conhe- cida co-eluição de potássio e amônio pôde ser resolvida na pre- sença de um éter coroa, com 6 átomos de oxigênio.
Agentes Modificadores da Superfície Capilar
Os capilares utilizados em eletroforese capilar são fabrica- dos com sílica fundida, uma forma pura de dióxido de silício amorfo. Este material confere aos capilares muitas proprieda- des importantes, como dimensões precisas, alta constante die- létrica, baixa condutividade elétrica, alta condutividade térmi- ca, resistência mecânica e particularmente, alta transmissão óptica para um intervalo apreciável do espectro (190 a 900 nm). Quimicamente, os capilares de sílica são caracterizados pela presença de vários grupos silanol (SiOH), os quais são
fracamente ácidos em caráter. Em contato com o meio aquoso, alguns destes grupos dissociam, tornando a superfície negati- vamente carregada. Os grupos silanol são diretamente relacio- nados com o fenômeno da eletroosmose 1,11. Além disto, estes oferecem sítios abundantes para interação coulômbica com certos solutos, e portanto por vezes têm um efeito adverso na qualidade da separação e detecção final. Vários procedimentos têm sido introduzidos para o controle da densidade de carga na parede do capilar, visando tanto o controle do fluxo eletroosmótico quanto a eliminação da inte- ração soluto-capilar. O uso de capilares revestidos internamen- te é uma prática comum. Nestes capilares, os grupos silanol são bloqueados quimicamente pela reação com ligantes polares do tipo organosilanos (trimetilclorosilano, γ-metacriloxipropil- trimetoxisilano), entre outros. Este tipo de revestimento tem se mostrado efetivo por um período de tempo limitado, devido à hidrólise reversível do oxigênio silil, particularmente em valo- res altos de pH. Talvez a maneira mais elegante de manipulação da carga superficial do capilar é a desativação dinâmica que decorre da adsorção física de agentes tensoativos catiônicos, tais como os alquil derivados dos sais quaternários de amônio. A escolha adequada do tamanho da cadeia do tensoativo como sua con- centração permite o controle direto da magnitude do fluxo ele- troosmótico e mesmo a sua inversão 24. A figura 5 ilustra as vantagens do controle de fluxo e pola- ridade da fonte de alta tensão, dentro do contexto da migração de ânions. Considere a introdução hidrodinâmica 1 de uma amostra contendo solutos aniônicos. A figura 5A exemplifica a separação sob fluxo eletroosmótico (eof) normal, fluxo direcionado ao catodo 1 , e polaridade positiva na extremidade do capilar onde é feita a injeção de amostra. Este tipo de aná- lise somente é possível no caso de ânions lentos (aromáticos, por exemplo), cuja mobilidade é menor que a mobilidade
Figura 4. Separação de cátions por eletroforese capilar com aditivos. (A) Eletrólito: 4-metilbenzilamina 8 mmol L -1^ , ácido lático 15 mmol L - (^1) e metanol 5 %, pH 4,25 (ref. 22, adaptado); (B) Eletrólito: imidazol
5 mmol L -1^ , ácido hidroxi-isobutírico 6,5 mmol L -1^ e 18-crown-6 ether 1 mmol L -1^ , pH 4,5; 214 nm (ref. 23, adaptado).
Figura 5. Representação esquemática da migração de ânions por ele- troforese capilar.
A limitação primária dos métodos eletroforéticos em solu- ção livre é a impossibilidade de separar compostos neutros, a menos que existam diferenças significativas de massa molecu- lar. Em geral, compostos neutros migram no capilar por ação exclusiva do fluxo eletroosmótico 1 , não havendo discriminação espacial e/ou temporal dos solutos na chegada ao detector. Em 1984, S. Terabe e colaboradores 29 introduziram uma versão modificada da eletroforese capilar, a eletrocromatografia mice- lar ou cromatografia eletrocinética micelar ( micellar electroki- netic capillary chromatography , MECC, ou micellar electroki- netic chromatography , MEKC). Nesta nova versão, agentes tensoativos iônicos, em condições apropriadas à formação de micelas, são adicionados ao eletrólito de corrida, proporcio- nando assim um sistema cromatográfico de duas fases. O ele- trólito representa a fase primária, a qual é transportada ele- troosmoticamente sob ação do campo elétrico, enquanto que as micelas representam a fase secundária, ou pseudo-estacionária, a qual é transportada por uma combinação de eletroforese e eletroosmose. A partição diferenciada de solutos neutros entre estas duas fases é responsável pela seletividade da separação. Problemas de co-eluição em MECC são em parte solucionados pela adição de uma fase complexante auxiliar. Toda uma clas- se de separações que faz uso de ciclodextrinas de diferentes tamanhos pertence a esta categoria, e vem sendo referida como MECC-CD. Sendo neutras, as ciclodextrinas migram com a
velocidade eletroosmótica. A partição diferenciada de solutos entre a micela e a cavidade da ciclodextrina produz a seletivi- dade extra requerida. A figura 8 esquematiza os principais mecanismos de transporte da eletrocromatografia em fase micelar e na presença de ciclodextrinas. Muito embora a ele- trocromatografia micelar tenha sido idealizada para separar solutos neutros, ela pode também auxiliar a separação de com- postos iônicos, e tem sido amplamente empregada como tal 30.
Agentes Tensoativos
Agentes tensoativos são compostos anfifílicos, i. e., contém na mesma molécula grupamentos com caráter hidrofóbico e hidrofílico 31. Compostos com estas características podem ser aniônicos, catiônicos, anfotéricos, ou ainda neutros, sem carga aparente, como moléculas com grupos fortemente polares. Em geral, o tensoativo contém um grupo polar e/ou iônico como cabeça ligado a uma cauda apolar, por exemplo, uma cadeia alifática, constituindo o monômero. Em condições apropriadas, monômeros podem agregar-se para formar entidades de tama- nho coloidal, como vesículas e micelas. Micelas são agregados organizados, de forma essencialmen- te esférica, em que a cauda hidrofóbica do monômero é direcionada para o centro da cavidade e a cabeça é orientada em direção à solução, definindo assim uma superfície. A natu- reza da micela, assim como o processo de micelização são ri- gorosamente dependentes das condições experimentais, tais
Figura 7. Representação esquemática da simetria de pico em função da similaridade das mobilidade do ânion do soluto e eletrólito.
Figura 8. Representação esquemática da migração de solutos neutros por eletrocromatografia em fase micelar aniônica (A) e na presença de uma fase auxiliar (B). Detalhe mostrando monômeros e micelas de SDS, ciclodextrina e a interação de diversos solutos neutros com ambas as fases. Um soluto não-retido pela micela migra com a velocidade do fluxo eletroosmótico, v (^) osm. A velocidade eletroforética da micela é v (^) e,M enquanto que sua velocidade aparente final é v (^) M.
como temperatura, tipo do solvente, etc. Micelas são formadas rapidamente quando a concentração de surfactante excede um valor específico, conhecido como concentração micelar crítica (CMC), e existem em equilíbrio dinâmico com o monômero: onde N é definido como o número de agregação, representando o número médio de monômeros agregados. Na tabela 3 foram selecionados os surfactantes mais comumente empregados em MECC e seus respectivos número de agregação e concentração micelar crítica. Os agentes tensoativos que apresentam altos valores de CMC são inadequados para MECC, pois as micelas formadas coexis- tem com grandes quantidades de monômero livre, o que repre- senta uma sobrecarga térmica (aumento de calor a ser dissipa- do pelo capilar). Entre os eletrólitos estudados para eletrocro- matografia micelar até a presente data, os sistemas que for- mam micelas cuja migração eletroforética se opõe ao fluxo eletroosmótico, embora apresentem mobilidade menor, são os que têm produzido melhores desempenhos. Exemplo típico é o dodecilsulfato de sódio (SDS). Assim, tanto a solução como as micelas migram no mesmo sentido, embora com velocidades diferentes (Figura 8A). A associação diferenciada entre os diversos solutos e a fase micelar é obviamente um requisito básico para o sucesso da separação. Dependendo da natureza do sistema, a incorporação do soluto pela micela pode envolver diferentes regiões da micela, e pode ocorrer por uma série de mecanismos. Solutos não-polares, ou moderadamente polares se associam ao núcleo hidrofóbico da micela, através de interações dispersivas do tipo dipolo induzido-dipolo induzido, enquanto que solutos polares se associam à superfície da micela, através de interações do tipo dipolo-dipolo ou íon-dipolo com os grupos polares (ou iônicos) da cabeça do tensoativo. Fortes interações coulômbicas
(atrativas ou repulsivas) podem resultar quando o soluto apre- senta carga. Solutos anfifílicos tendem a se alinhar com a micela, de forma a interagir dispersivamente com o núcleo hidrofóbico e eletrostaticamente com a cabeça do tensoativo. A extensão com que a associação soluto/micela ocorre deter- mina a ordem de eluição dos solutos.
Vantagens e Limitações
A MECC oferece várias vantagens em relação a outras téc- nicas alternativas de separação. A instrumentação básica é idên- tica à empregada em eletroforese de zona em solução livre 1 , no entanto a MECC é mais versátil. Em MECC, diferenças de mobilidade eletroforética podem ser exploradas para separar solutos iônicos, ao mesmo tempo que, diferenças de distribui- ção entre a fase micelar e o eletrólito podem ser usadas para separar solutos neutros. A MECC apresenta uma eficiência muito maior, quando comparada às técnicas cromatográficas similares (pareamento iônico, por exemplo), em decorrência das características inerentes ao fluxo eletroosmótico, particu- larmente do caráter linear do perfil radial da velocidade 1. Além disso, a uniformidade das micelas, em termos de distribuição de tamanho, minimiza os problemas associados com a resistên- cia à transferência de massa ( vide próxima seção). Apesar de ser uma técnica eletroforética com extensa vari- edade de aplicações, a MECC apresenta algumas limitações de ordem prática e teórica. Em eletrocromatografia micelar, a ra- zão entre o volume das fases (V (^) micela /V (^) solução ) é relativamente grande: uma solução 0,5 mol L -1^ de dodecilsulfato de sódio, por exemplo, apresenta uma razão de fases maior que 0,01. Este fator, considerando que micelas são instáveis em soluções aquosas contendo altos teores de solventes orgânicos, em ge- ral, impossibilita o uso de MECC para solutos com forte cará- ter apolar. Nestas condições, tais solutos são completamente retidos pela micela, e portanto, não são diferenciados quando atingem o detector. Além disso, em razão da velocidade e do volume efetivo das micelas dependerem criticamente das con- dições da separação, a reprodutibilidade do tempo de eluição exige um controle cuidadoso das condições experimentais. Comparativamente a outras técnicas eletroforéticas, a MECC possui uma baixa capacidade de picos, o que limita seu uso a misturas não muito complexas. Esta característica está direta- mente relacionada ao fato de que em MECC, a fase secundária
(micelas) está em movimento e, conseqüentemente, todos os solutos, mesmo os totalmente retidos pela micela, são eluídos. Isto limita o tempo em que a separação deve ocorrer a um intervalo característico. De acordo com a figura 9, os solutos só podem eluir entre os tempos t 0 (soluto não-retido pela
Tabela 3. Concentração micelar crítica (CMC) e número de agregação (N) para tensoativos de uso comum em eletrocromatografia micelar.^31
Agente Tensoativo Estrutura/Fórmula CMC N (abreviação) (mmol L -1^ )
Aniônico : Dodecil sulfato de sódio (SDS) C 12 H 25 OSO 3 -^ Na +^ 8,1 62 Octil sulfato de sódio (SOS) C 8 H 17 OSO 3 -^ Na +^136
Catiônico : Cloreto de hexadecil-trimetil-amônio (CTAC) C 16 H 33 N +^ (CH 3 ) 3 Cl -^ 1,3 78 Brometo de dodecil-trimetil-amônio (DTAB) C 12 H 25 N +^ (CH 3 ) 3 Br -^15
Anfotérico : N-dodecil sultaína (SB-12) C 12 H 25 (CH 3 ) 2 N +^ CH 2 CH 2 CH 2 SO 3 -^ 1,2 —
Não-iônico : Polioxietileno-t-octilfenol (Triton X-100) (CH 3 ) 3 CCH 2 C(CH 3 ) 2 C 6 H 4 0,2 143 (OCH 2 CH 2 ) (^) 9.5 OH
Bile : Deoxicolato de sódio (NADC) 6,4 14
Figura 9. Intervalo característico de eluição em eletrocromatografia micelar.
micela, ou simplesmente um soluto neutro, que migra apenas por ação do fluxo eletroosmótico), e t (^) M (tempo de migração da micela). Assim, o fator t 0 /t (^) M expressa convenientemente o in- tervalo útil de separação em MECC.
Equações Fundamentais
Em decorrência do intervalo limitado de tempos de eluição, as equações fundamentais da cromatografia não são estritamen- te aplicáveis à eletrocromatografia micelar. Em eletrocromato- grafia, o fator de capacidade de um soluto (quantidade de soluto presente na fase estacionária em relação à presente na fase móvel), k', é expresso como:
k ' =
t (^) R − t 0 t 0 (1 - t (^) R / t (^) M ) (5)
onde t (^) R é o tempo de retenção do soluto. Note que, quando t (^) M
não ser adequados para MECC. Solutos interagindo com micelas de diferentes tamanhos exibem um amplo intervalo de velocida- des de migração e podem produzir bandas largas. Um aumento da concentração do tensoativo, assim como um aumento de tem- peratura, podem contribuir para acelerar o processo de troca entre micela e monômero, melhorando a eficiência da separação. Efeitos adversos relacionados com a resistência à transfe- rência de massa entre as fases pseudo-estacionária e móvel também podem ocorrer em MECC. Em geral, baixas voltagens e altos coeficientes de difusão do soluto minimizam estes efei- tos. A contribuição da resistência à transferência de massa na fase pseudo-estacionária é em geral de pequena magnitude para solutos não-polares, em decorrência do tamanho das micelas (≈ 40 Angstrons para SDS) e da cinética rápida da interação soluto/micela. No entanto, devido à natureza das forças envol- vidas, o processo de partição entre solutos polares ou iônicos e a micela pode apresentar uma cinética lenta, e causar o alar- gamento das bandas. Resistência à transferência de massa na fase móvel envolve dois processos distintos: difusão intermicelar e intracoluna. O efeito intermicelar ocorre porque a difusão do soluto entre as micelas é um processo lento. Este processo é análogo ao que ocorre em colunas empacotadas usadas em cromatografia à lí- quido, onde a difusão rápida do soluto entre as partículas do recheio é de extrema importância. Mesmo em concentrações moderadas de tensoativo, a distância entre as micelas é extre- mamente pequena, dificultando a passagem do soluto. No en- tanto, verifica-se em MECC, uma menor resistência à transfe- rência de massa na fase móvel quando comparada à cromato- grafia à líquido em colunas empacotadas. As micelas constitu- em uma fase secundária mais uniforme e homogeneamente dis- persa (devido à repulsão coulômbica entre as micelas) e têm dimensões menores que as partículas usadas nas colunas empa- cotadas. Devido à quase perfeita distribuição de micelas e sua natureza fluídica, diferenças de percurso na migração dos solutos são praticamente eliminadas, explicando-se assim a maior eficiência obtida nas separações por MECC. Em cromatografia, a resistência à transferência de massa intracoluna é conseqüência do perfil de velocidade parabólico da fase móvel. Moléculas do soluto localizadas no centro da coluna movem-se mais rapidamente que as moléculas próxi- mas à parede. Um efeito semelhante ocorre em colunas empa- cotadas, no qual as moléculas localizadas entre as partículas do recheio experimentam um fluxo parabólico local. Em MECC, a lenta transferência de massa intracoluna irá contri- buir para o alargamento das bandas somente se existir um gra- diente de velocidade radial no capilar. Tais gradientes podem ser originados por efeitos térmicos apenas, já que a natureza do fluxo eletroosmótico, constância do perfil radial da veloci- dade, minimiza esta fonte de dispersão.
Aplicações
A figura 10 apresenta uma série de aplicações representati- vas de MECC, exemplificando a separação de drogas de uso farmacêutico e compostos de interesse ambiental. Vários aditivos que encontram aplicação prática em eletrocromatogra-
fia micelar estão compilados na tabela 4. O surfactante mais comumente empregado em separações micelares é sem dúvida, o dodecil sulfato de sódio (Figura 10 A, C e D). Misturas de tensoativos podem ser empregadas para gerar micelas mistas. Surfactantes não-iônicos, como Brij-35 ou Triton X-100, po- dem ser usados para diminuir a carga efetiva do SDS. Como resultado, é possível modular o tempo de análise pela escolha da concentração do surfactante não-iônico, sem recorrer a um aumento de campo elétrico. Outros surfactantes são escolhidos tendo em vista determinados efeitos. Um exemplo relevante é o uso dos sais de bile. A estrutura molecular destes agregados difere grandemente da proporcionada pelos surfactantes de ca- deia alifática longa. Além de apresentarem uma cavidade menos hidrofóbica que as de SDS, o que é particularmente interessante para a separação de solutos fortemente apolares, as micelas de sais de bile são úteis nas separações quirais. A separação de corticoesteróides em micelas de sais de bile é apresentada na figura 10B. Um exemplo importante do poder de resolução ob- tido pelo uso de ciclodextrinas é ilustrado pela figura 10D, que mostra a separação MECC-CD de hidrocarbonetos aromáticos polinucleares (PAH), compostos de grande impacto ambiental.
I.3. Eletroforese Capilar em Gel
A eletroforese capilar em gel ( capillary gel electrophoresis , CGE) tem sido extensivamente utilizada na separação de com- postos de caráter iônico e alta massa molecular 4,8^. Neste tipo de eletroforese, os solutos migram através de uma estrutura polimérica, sendo mais ou menos impedidos em seu percurso, de acordo com o seu tamanho, processo este conhecido como peneiramento (Figura 11). Macromoléculas, tais como oligo- nucleotídeos, fragmentos de DNA e proteínas de alta massa molecular, não podem, de fato, ser separadas sem este tipo de matriz. Nestas moléculas, a razão entre a massa e a carga (m/ z) não varia com o aumento da massa molecular. Sendo assim, a mobilidade permanece a mesma, não havendo discriminação temporal e/ou espacial dos oligômeros em um sistema de ele- troforese em solução livre. A restrição seletiva na passagem de moléculas de diferentes tamanhos pela matriz polimérica é por- tanto condição necessária para a separação ocorrer. Géis são estruturas porosas, em que um componente fluido é imobilizado numa rede polimérica. As cadeias de um polí- mero podem ser interligadas por processos físico-químicos (li- gações covalentes, interações de Van de Waals) definindo os géis químicos, e/ou emaranhadas mecanicamente (géis físicos ou polímeros enovelados). Numa classificação mais rigorosa, os géis químicos são compostos apenas de partículas coloidais liofílicas, e.g. poliacrilamida, enquanto que os colóides liofó- bicos são melhor designados como sóis, e.g. agarose. A distân- cia média entre as ligações, distribuição dos pontos de ligação e conteúdo líquido governam o tamanho e a distribuição dos poros no gel. Uma vez formados, os géis são estruturas delica- das, sujeitas a mudanças de morfologia pela ação da tempera- tura, pH, força iônica e concentração do meio. Portanto, as condições em que um gel é preparado e manipulado devem ser rigorosamente controladas, pois afetam não só a diferenciação de moléculas com diferentes massas moleculares, como tam-
Tabela 4. Aditivos de eletrólito comumente empregados em eletrocromatografia micelar.
Aditivo Função e/ou Efeito
Ciclodextrinas Fase complexante auxiliar. Empregadas nas separações quirais.
Sais de Bile Cavidade micelar moderadamente hidrofóbica. Empregados nas separações quirais.
Solventes Orgânicos Ajuste do coeficiente de partição do soluto. Alteração da seletividade.
Surfactantes não-iônicos Formação de micelas mistas. Promovem separações mais rápidas.
Uréia Solubilização de proteínas, DNA, hidrocarbonetos e aminoácidos. Propicia o aumento do intervalo de eluição.
Tradicionalmente, os géis empregados em eletroforese de placa ( slab gel ) eram produzidos in situ pela polimerização de poliacrilamida com um agente apropriado, ou pela gelatinização de uma solução aquecida de agarose, em meio tamponado. Estes géis eram então moldados em blocos de aproximadamente 0,2 a 5 mm de espessura ou colocados em tubos com 0,5 a 10 mm de diâmetro. Durante a eletroforese, os solutos eram separados em bandas, sendo que moléculas pequenas percorriam distâncias maiores. Após a separação, as bandas eram visualizadas atra- vés de técnicas de tingimento. No formato capilar, a eletroforese em gel faz uso de polímeros lineares (poliacrilamida, metilcelulose, derivados de celulose hidroxilada, polivinilálcool, dextran), polímeros com ligações cruzadas, do tipo covalente (poliacrilamida, bis-acrilamida) ou pontes de hidrogênio (agarose) e polímeros enovelados (óxido de polietileno). Apesar do uso indiscriminado de géis de poliacrilamida, é importante observar que na prática, tais géis exibem como inconveniente, a instabilidade hidrolítica. Por esta razão, o uso destes géis é limitado a intervalos restritos de pH,
Figura 10. Aplicações representativas da eletrocromatografia micelar. (A) Eletroferograma de vitaminas em tampão de borato 50 mmol L -1^ , NaCl 20 mmol L -1^ e SDS 50 mmol L -1^ , pH 9,1; 200 nm; ref. 32, adaptado; (B) Eletroferograma de corticoesteróides em tampão de borato 100 mmol L - (^1) em presença de um sal de bile (colato) 100 mmol L -1 (^) , pH 8,45; 254 nm; ref. 33, adaptado); (C) Eletroferograma de pesticidas em tampão de fosfato
12 mmol L -1^ , borato 8 mmol L -1^ e SDS 100 mmol L -1^ , pH 8,9; ref. 34, adaptado; (D) Eletroferograma de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos em tampão de borato 100 mmol L -1^ , uréia 20 mmol L -1^ , γ -ciclodextrina 20 mmol L -1^ e SDS 100 mmol L -1^ , pH 9; ref. 35, adaptado.
Figura 11. Representação esquemática da migração de solutos de mobilidade semelhante em uma matriz porosa na ausência de fluxo eletroosmótico.
bém a consistência dos resultados analíticos.
gação. A evolução do gradiente de pH e perfil de concentração dos anfólitos ao longo do capilar é ilustrada na figura 14. Ini- cialmente, a solução contida no capilar está uniformemente dis- tribuída e possui um pH único (Figura 14A). Uma voltagem pequena, geralmente de 4 a 6 kV, é então aplicada ao sistema. Por ação do campo elétrico, solutos e anfólitos sofrem altera- ção de carga ao atravessar regiões de diferentes pH, e eventu- almente começam a separar-se em bandas individuais. A mi- gração dos anfólitos causa um aumento de pH do eletrólito próximo ao catodo, enquanto que o pH da região anódica de- clina, assim que os anfólitos de baixo pI (negativamente carre- gados) migram naquela direção (Figura 14B). A migração in- dividual prossegue até que um estado estacionário é estabele- cido, onde cada composto adquire carga efetiva nula, e atinge sua posição final. O pH equivalente a esta posição é igual ao pI do composto em questão. Neste ponto, o composto cessa de migrar eletroforeticamente. Esta etapa é conhecida como focalização. O sistema não distingue entre o anfólito e o soluto,
Figura 12. Aplicações representativas da eletroforese capilar em matriz porosa. (A) Eletroferograma de proteínas denaturadas com SDS em tampão ProSort TM^ (Perkin-Elmer, polímero enovelado); ref. 39, adaptado; (B) Eletroferograma de uma fita de DNA em tampão TBE (Tris-borato 89 mmol L -1^ e EDTA 2,5 mmol L -1^ ); capilar: gel de agarose (1,7% SeaPrep, FMC Corp.); ref. 40, adaptado; (C) Eletroferograma de uma fita de DNA em tampão Tris-borato 100 mmol L -1^ , pH 8,3; capilar: gel de poliacrilamida de ligação cruzada (3%T e 0,5%C); ref. 14, adaptado; (D) Eletroferograma de polímeros etoxilados não-iônicos, derivatizados com anidrido ftálico em tampão de Tris-borato, pH 8,3 (280 nm); capilar: μ -PAGE-3 (J&W Scientific, gel de poliacrilamida com ligação cruzada); ref. 41, adaptado.
Figura 13. Representação esquemática da focalização de solutos anfo- téricos de diferentes pI em eletroforese capilar por focalização isoelé- trica na ausência de fluxo eletroosmótico.
ambos são compostos anfóteros e portanto migram enquanto tiverem carga, e focalizam de acordo com o pI. Embora os solutos sejam separados em bandas distintas, a completa sepa- ração de anfólitos adjacentes nunca é obtida, pois isto causaria uma descontinuidade no gradiente de pH. O status da focaliza- ção é monitorado através da corrente. Quando a corrente decai para 10 a 25% de seu valor inicial, a voltagem aplicada ao sistema é interrompida, denotando assim, o final da etapa de focalização. Uma característica importante desta etapa é o esta- belecimento de um estado estacionário, no qual os componentes da amostra são focalizados em bandas de espessura reduzida. Estas bandas irão permanecer como tal, enquanto o campo elétrico existir. Se uma molécula do soluto (representada pelo símbolo • na Figura 15), pertencente a uma banda já focalizada, difunde em direção à solução circunvizinha ela imediatamente adquire carga, perdendo ou ganhando prótons. Adquirindo car- ga, a molécula novamente migra, por eletroforese, em direção ao eletrodo de carga oposta, retornando portanto à banda origi- nal. Este efeito de auto-focalização gera bandas extremamente finas, conferindo à focalização isoelétrica altíssima eficiência e um grande poder de resolução. Uma vez que os solutos só podem ser monitorados durante sua passagem pelo detector, e a posição do detector é fixa, é preciso mobilizar as bandas estacionárias até o detector, sem que haja perda da resolução obtida durante a etapa prévia de focalização. A mobilização pode ser conseguida através da apli- cação de pressão (mobilização hidrodinâmica) ou de voltagem (mobilização eletroforética). Neste último caso, a adição de um sal ao reservatório contendo o anólito ou católito se faz necessária. A mobilização eletroforética é em geral preferida porque perda de resolução das bandas pré-focalizadas é com-
Figura 14. Evolução do gradiente de pH e perfil da concentração dos anfólitos, ao longo do capilar, antes (A) e depois (B) da etapa de focalização.
Figura 15. Focalização de um soluto anfotérico em um gradiente de pH.
Figura 16. Mobilização eletroforética catódica e anódica por adição de um sal inerte (NaCl).
parativamente menor. A figura 16 ilustra a etapa de mobilização eletroforética nas direções catódica e anódica. A mobilização catódica é usual- mente selecionada, a menos que na amostra existam compostos muito ácidos. O processo de mobilização ocorre por imposição da eletroneutralidade. No estado estacionário, a seguinte con- dição é satisfeita:
C (^) H+ + Σ C (^) BH+ = C (^) OH - + Σ C (^) A - (13)
onde C (^) H+ , C (^) OH -, C (^) BH + e C (^) A - representam as concentrações molares de todas as espécies iônicas presentes na mistura de anfólitos. Se um sal do tipo X (^) m Y (^) n é adicionado ao católito, a equação de balanço de massa é alterada para:
C (^) H+ + Σ C (^) BH+ = C (^) OH - + Σ C (^) A - + C (^) Ym- (14)
onde C (^) Ym- é a concentração molar do ânion e m -^ representa sua carga. O ânion adicionado compete com OH- em sua eletromi- gração para o interior do capilar. Em decorrência desta compe- tição, uma quantidade menor de hidroxilas entra no capilar, e portanto o pH decai. Solutos que já estavam focalizados no pH igual ao pI tornam-se catiônicos com a diminuição local de
mesmo critério deve ser praticado, sendo que, neste caso, é a mobilidade do ânion, o fator a ser considerado na escolha dos eletrólitos líder e terminador. Solutos com mobilidade superior à do líder não são separados por CITP; estes migram mais rapida- mente que o líder e seguem portanto, o mecanismo de separação por eletroforese de zona. Por outro lado, a escolha de um terminador moderadamente rápido remove, do isotacoferograma, os componentes da amostra com mobilidade inferior, sendo as- sim, uma maneira elegante de discriminar, na amostra, os solutos indesejáveis. A tabela 5 apresenta a composição de alguns siste- mas de eletrólitos comumente empregados em CITP. Alguns aditivos como hidroxi-isopropilmetilcelulose (HPMC), polietile- no glicol (PEG), polivinil álcool, Triton X-100 e Brij 35 são em geral escolhidos para auxiliar a solubilização de certos solutos, ou como modificadores do fluxo eletroosmótico. A isotacoforese possui duas características marcantes: a exis- tência de um estado estacionário, em que todas as bandas mi- gram com a mesma velocidade, e o fato de que cada banda é essencialmente focalizada. Quando o campo elétrico é aplica- do, diferentes gradientes de potencial evolvem em cada banda (Fig. 18, traçado inferior), de tal forma que todos os solutos
eventualmente migram com velocidades idênticas, i.e., com a velocidade isotacoforética , v (^) itp. Em regiões onde cátions de menor mobilidade estão presentes, o campo elétrico é mais intenso. Estes solutos, entretanto, movem-se com a mesma velocidade que os solutos de maior mobilidade, submetidos a campos elétricos mais fracos. Portanto, as velocidades das ban- das individuais são auto-normalizadas:
vitp = μL E (^) L = μS1 E (^) S1 = μS2 E (^) S2 = μS3 ES3 = ...... = μT E (^) T (16)
onde os índices L, S e T denotam os íons do líder, solutos e teminador, respectivamente. A capacidade de picos das separações isotacoforéticas é apreciavelmente grande, uma conseqüência da maneira pela qual as bandas migram, adjacentes uma às outras, mantendo a continuidade elétrica. A focalização das bandas em isotacoforese é também resul- tante da normalização da velocidade. Se uma molécula do soluto atinge, por difusão, uma banda subseqüente, onde pre- valece um campo elétrico menor, sua velocidade é decrescida e a molécula retorna à banda original. Da mesma forma, se uma molécula difunde para a banda precedente, onde existe um campo elétrico mais intenso, sua velocidade de migração é momentaneamente aumentada e a molécula alcança a banda de origem. Na figura 18, a auto-focalização da banda S 2 é repre- sentada por duas flechas diametralmente opostas. Em CITP é comum a eliminação do fluxo eletroosmótico, embora não necessária. Os capilares tipicamente usados são de sílica fundida ou teflon, com diâmetros apreciavelmente maio- res que os empregados em eletroforese de zona ( c. a. 500- μm), dado o aspecto focalizante da técnica. A injeção de amos- tra pode ser realizada tanto pelo método hidrodinâmico quanto eletrocinético 1. A análise isotacoforética é em geral realizada sob corrente constante. Nestas condições, quando os solutos de menor mobilidade são introduzidos no capilar, a voltagem au- menta proporcionalmente, permitindo assim análises rápidas, sem os problemas relacionados com o aquecimento pelo efeito Joule. Alternativamente, a separação pode ser conduzida sob voltagem constante, no entanto, com o prejuízo de um tempo de análise prolongado. A figura 19 apresenta esquemas de separação para cátions e ânions por isotacoforese capilar. Na CITP catiônica, a ordem de migração dos solutos é idêntica, seja na presença (Fig. 19A) ou ausência de fluxo (Fig. 19B). O capilar é inicialmente pre- enchido com o eletrólito líder e, após injeção da amostra, a separação é efetuada com o eletrólito terminador. A polaridade
Tabela 5. Composição de alguns sistemas tampão comumente empregados em isotacoforese capilar. 49
CITP Catiônica
Íon do líder HCl 10 mmol L -1^ KOAc 10 mmol L - Contra-íon do líder HOAc pH do líder 2,0 4,
Íon do terminador TRIS 10 mmol L -1^ HOAc 10 mmol L - Contra-íon do terminador HCl pH do terminador 8,
CITP Aniônica
Íon do líder HCl 10 mmol L -1^ HCl 10 mmol L -1^ HCl 10 mmol L - Contra-íon do líder β-alanina L-histidina Ammediol Aditivo 0,2% HPMC 0,2% HPMC 0,2% HPMC pH do líder 3,3 6,0 8,
Íon do terminador Ác. Capróico MES β-alanina 10 mmol L -1^ 10 mmol L -1^ 10 mmol L - Contra-íon do terminador Tris Ba(OH) (^2) pH do terminador 6,0 9,
Ammediol: 2-amino-2-metil-1,3-propanodiol; HPMC: hidroxipropil-metil-celulose; MES: ácido 2-[N-morfolino] etanossulfônico; TRIS: Tris(hidroximetil)amino metano
Figura 18. Representação esquemática da migração de solutos catiôni- cos, S (^) n , por isotacoforese capilar na ausência de fluxo eletroosmótico. O eletrólito líder é L, o terminador é T e a velocidade isotacoforética é v (^) itp.
da fonte de alta tensão é positiva na extremidade do capilar onde é feita a injeção de amostra. Nestas condições, a veloci- dade isotacoforética e velocidade eletroosmótica, se existir, são direcionadas ao catodo (aterrado). Na separação de ânions em presença de fluxo (Fig. 19C), a situação é diferente: o fluxo eletroosmótico continua direcionado ao catodo, mas a veloci- dade isotacoforética é dirigida ao polo oposto. Neste caso, o capilar deve ser preenchido inicialmente com o eletrólito terminador, sendo a corrida feita com o líder. A polaridade per- manece positiva na extremidade de injeção. Uma vez que a ve- locidade eletroosmótica ultrapassa a velocidade isotacoforética, os solutos, embora aniônicos, migram em direção ao catodo, atin- gindo o detector, em ordem decrescente de mobilidade. Na CITP aniônica sob fluxo suprimido (Fig. 19D), a amostra é injetada na coluna já preenchida com o eletrólito líder. Apenas a polaridade da fonte deve ser invertida, isto é, negativa na extremidade de injeção, para que os solutos sejam conduzidos ao detector. Muito embora existam instrumentos especiais para isotaco- forese, esta pode ser praticada em equipamentos convencionais de eletroforese capilar, que na maioria utilizam detectores ópticos baseados na medida de absorbância na região do UV- Vis. Cabe salientar aqui, que recentemente foi introduzido no mercado, um equipamento para eletroforese capilar com detecção em linha por condutividade elétrica 50 , que portanto, também pode ser utilizado para isotacoforese. Eletroferogramas gerados por isotacoforese capilar diferem dos traçados tipicamente obtidos por outros métodos eletroforé- ticos. Quando a detecção por condutividade é empregada (Figu- ra 20), o registro do sinal decresce por degraus, onde cada plateau representa uma das bandas. Assim, no início da corrida, a condutividade é alta devido à presença do eletrólito líder, que contém os íons de maior mobilidade, decresce com a passagem dos solutos, e finalmente estabiliza em um valor mínimo, cor- respondente à condutividade do eletrólito terminador, que no final da corrida preenche totalmente o capilar. A informação analítica provém da largura da banda, que é proporcional à con- centração original do soluto na amostra, e não da altura ou área dos picos como nos demais métodos de separação análogos. Um aspecto interessante da isotacoforese sob corrente constante é que, cada banda, ao atingir o estado estacionário, apresenta a concentração do eletrólito líder. Assim, solutos inicialmente menos concentrados na amostra apresentam, no capilar, bandas contraídas, enquanto que os mais concentrados apresentam ban- das expandidas. Uma vantagem proeminente da isotacoforese capilar é a pré-concentração de amostras diluídas, capacitando a técnica para a análise de traços. O traçado não usual dos isotacoferogramas pode gerar equí- vocos na identificação dos solutos. Aqui, o tempo de migração não é informativo da identidade provável do soluto, outra dife- rença marcante em relação aos outros métodos eletroforéticos.
Figura 19. Migração isotacoforética catódica (A, B) e anódica (C, D) em capilares de sílica fundida (A, C) e teflon (B, D).
Figura 20. Isotacoferograma com registro temporal da condutividade.
Desta forma, a ordem de passagem dos solutos pelo detector não se relaciona com a composição qualitativa da amostra. Por exem- plo, quando componentes que não estão presentes no padrão, aparecem na amostra, a ordem relativa das bandas é alterada. Este fato contribui para que o desenvolvimento de metodologia em isotacoforese seja considerado mais complexo, quando com- parado à eletroforese de zona em solução livre, onde o conheci- mento da composição da amostra não é tão crítico. A figura 21 apresenta um isotacoferograma típico de uma mistura de amino-ácidos, mostrando dois traçados, o de condu- tividade e o de absorbância. É interessante observar que apenas dois dos solutos da mistura são visualizados no registro de absor- bância: N-benzoil-alanina e ácido benzóico. Assim sendo, os de- mais solutos podem ser usados como espaçadores. Espaçadores são compostos que não apresentam absorbância no comprimento de onda selecionado para a análise, e possuem uma mobilidade intermediária à dos solutos que se deseja separar. Além de auxi- liar a resolução de compostos de mobilidade semelhante, um espaçador pode facilitar a detecção dos solutos de interesse e viabilizar a coleta de frações. Cabe ressaltar que, durante a coleta de frações, os solutos estão isentos do eletrólito, aspecto bastante vantajoso no preparo de drogas, por exemplo.
CONCLUSÃO
As análises por eletroforese capilar estão fundamentadas em mecanismos diversos de separação. A implicação direta desta versatilidade define o aspecto mais impressionante da técnica:
- Comstock, M. J., Ed.; Organized Surfactant Assemblies in Separation Science ; American Chemical Society; Wa- shington, DC, 1987.
- Water Soluble Vitamins ; Perkin-Elmer, Applied Biosys- tems Division; Application note CEPH14.
- Weinberger, R.; Practical Capillary Electrophoresis; p 165; Academic Press; New York, 1993.
- Heiger, D.; Herold, M.; Grimm, R.; Pesticides analysis by MEKC ; Applications of the HP 3D^ Capillary Electrophoresis System; Hewlett-Packard; Vol.1; p51; França, 1994.
- Terabe, S.; Miyashita, Y.; Ishihama, Y.; Shibata, O.; J. Chromatogr. 1993 , 636 , 47.
- Cohen, A. S.; Paulus, A.; Karger, B. L.; Chromatographia 1987 , 24 , 15.
- Cohen, A. S.; Karger, B. L.; J. Chromatogr. 1987 , 397 ,
- Drossman, H.; Luckey, J. A.; Kostichka, A.; D’Cunha, J.;
Smith, L. M. Anal. Chem. 1990 , 62 , 900.
- Protocolo: ProSort SDS-Protein Analysis by Capillary Electrophoresis ; Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, 1993.
- Bocek, P.; Chramback, A.; Electrophoresis 1992 , 13 , 31.
- Wallingford, R. A.; Anal. Chem. 1996 , 68 , 2541.
- Righetti, P. G.; Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications ; Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology; Work, T. S.; Burdon, R. H.; Eds.; Elsevier, Amsterdam, 1983.
- Protocolo: ProFocus Capillary Isoelectric Focusing ; Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, 1993.
- Everaerts, F. M.; Beckers, J. L.; Verheggen, Th. P. E. M.; Isotachophoresis Theory, Instrumentation and Applicati- ons ; Elsevier, Amsterdam, 1976.
- Bocek, P.; Deml, M.; Gebauer, P.; Dolník, V.; Analytical Isotachophoresis ; VCH, 1988.
- Bocek, P.; Gebauer, P.; Dolník, V.; Foret, F.; J. Chroma- togr. 1985 , 334 , 157.
- Kasicka, V.; Prusik, Z.; J. Chromatogr. 1991 , 569 , 123.
- Hirokawa, T.; Nishino, M.; Aoki, N.; Kiso, Y.; Sawamoto, Y.; Yagi, T.; Akiyama, J.; J. Chromatogr. 1983 , 271 , D1.
- Weinberger, R.; Practical Capillary Electrophoresis ; Aca- demic Press, New York, 1993.
- Haber, C.; Jones, W. R.; Soglia, J.; Surve, M. A.; McGlynn, M.; Caplan, A.; Reineck, J. R.; Krstanovic, C.; J. Cap. Elec. 1996 , 3 , 1.
- Stehle, P.; Bahsitta, H. -P.; Furst, P.; J. Chromatogr. 1986 , 370 , 131.
