Baixe Microscopia - Histórico e teoria e outras Manuais, Projetos, Pesquisas em PDF para Microscopia, somente na Docsity!
5. MICROSCOPIA DE LUZ
BREVE HISTÓRICO DA MICROSCOPIA
O ser humano sempre demonstrou necessidade de superar suas próprias limitações físicas. Ver além da capacidade do seu sistema visual foi, talvez, o maior desafio enfrentado sob essa perspectiva. Foram assim desenvolvidos os equipamentos que permitiam ver mais longe, como os telescópios, e ver o mundo do muito pequeno: o microscópio. O conhecimento das propriedades inerentes às lentes data de antes da era cristã. Há registros da construção de boas lentes para óculos já no século 13, na Itália. O microscópio apareceu bem depois desse tempo. O primeiro registro de um microscópio composto (Figura 1) data de ~1595; foi construído pelo holandês Zacharias Janssen, com a ajuda de seu pai Hans, e ampliava a imagem dos objetos em até dez vezes. Foi no século 17 que os microscópios passaram a ser mais largamente utilizados, especialmente por cientistas interessados em descobrir detalhes do mundo biológico. Foi em 1665 que Robert Hooke publicou seu livro Micrographia , no qual relata e desenha objetos e organismos vistos através do microscópio (Figura 2 ). Também nesse século (1683), Antonie van Leeuwenhoek publicou a carta Philosophical Transactions , na qual relata observações feitas em um microscópio construído por ele mesmo, com aumentos de até 300 vezes; ele foi o primeiro cientista a fazer desenhos de espermatozóides, protozoários, e hemácias. Ainda de destaque desse século estão as descobertas e publicações de Galileu Galilei e Isaac Newton.
Figura 1 – Microscópio de Janssen, construído no século 16.
Figura 2 – Microscópio utilizado por Hooke para descrever suas observações. Ele cunhou o termo célula, ao observar cortes finos de cortiça.
Até o início do século 19 os microscopistas ainda enfrentavam problemas com a construção de lentes; eram muitas as aberrações ópticas, as imagens ficavam borradas. Foi nas décadas de 1810 e 1820 que novas revoluções trouxeram avanços no campo da microscopia. Giovanni Battista Amici, em 1827, introduziu as primeiras lentes acromáticas para microscopia, melhorando em muito a qualidade das imagens obtidas. Foi também ele que introduziu as primeiras lentes de imersão em óleo, em 1840, possibilitando a obtenção de imagens com melhor resolução pela imersão do objeto de estudo em um meio com índice de refração maior que o do ar; e as lentes de imersão em água, em 1855. Paralelamente a essas inovações em microscopia, algumas importantes descobertas da física valem destaque: em 1846, Michael Faraday propôs que eletricidade e magnetismo são dois aspectos de uma mesma força e que a luz talvez fosse ainda mais um aspecto dessa força. A partir dos trabalhos desse físico e químico foi que James Clerk Maxwell, em 1865, determinou matematicamente que as ondas eletromagnéticas viajam na velocidade da luz e propôs, assim, que a luz também deveria ser uma onda eletromagnética. Heinrich Hertz idealizou e realizou os experimentos que comprovaram a teoria proposta por Maxwell. Em 1879, Thomas Edison inventou a lâmpada elétrica de bulbo. Datam também do século 19 os brilhantes trabalhos desenvolvidos por Ernst Abbe (Figura 3 ), um físico alemão que, em parceria com Carl Zeiss, criou a que é hoje uma das maiores empresas no ramo de microscopia. Abbe, trabalhando com os conceitos de luz enquanto onda eletromagnética, escreveu a teoria da formação da imagem em um microscópio com grandes detalhes; em 1873 estabeleceu a correlação entre comprimento de onda () e abertura numérica (AN) das lentes do microscópio para calcular o limite de resolução (LR) da imagem (pág. 30 ). Mais tarde, a partir de experimentos sobre difração de luz e formação de imagem, propôs que se uma lente (ou conjunto de lentes) for completamente corrigida para as aberrações, a resolução real da imagem será próxima daquela deduzida teoricamente; isso hoje é quase um fato. Ele introduziu várias propostas de melhoramentos na construção de
Figura 3 – Ernst Abbe pode ser considerado o paid a microscopia moderna.
microscópio que levou seu nome e é utilizada até os dias atuais. A iluminação de Köhler (ver Métodos de Iluminação) permite que a luz seja igualmente distribuída pelo campo visual, sendo geralmente a mais adequada para observações e fotografias. Köhler foi contratado pela companhia de Carl Zeiss em 1900 e lá permaneceu por mais 45 anos, sempre contribuindo com inovações no design de microscópios; foi dele a sugestão de se usar objetivas parfocais (com planos focais iguais), o que permitia manter a imagem no foco quando um observador mudava a ampliação no microscópio. Também foi ele, em um trabalho conjunto com Moritz van Rohr, quem planejou e construiu o primeiro microscópio que trabalhava com luz ultravioleta, o pai da microscopia de fluorescência. A última década do século 19 foi marcada, ainda, pelo aparecimento de microscópios metalográficos, microscópios binoculares, prismas de correção de imagem, e o primeiro estereomicroscópio. O século 20 iniciou-se com uma revolução dramática que mudou a forma como cientistas entendem as propriedades básicas de matéria e energia. Os trabalhos desenvolvidos pelos físicos Max Planck e Albert Einstein colocaram a ciência no mundo quântico, permitindo novas abordagens inclusive em microscopia. Em 1924, a empresa de Carl Zeiss desenvolveu os primeiros microscópios de óptica infinita, tecnologia que foi definitivamente incorporada aos equipamentos somente na década de 1980. Em 1931, Ernst Ruska (Figura 5) desenvolveu as primeiras peças de um microscópio eletrônico e, em 1933, construiu o primeiro microscópio eletrônico, que lhe valeu o prêmio Nobel em
Em 1930, enquanto estudava grades de difração, o holandês Frits Zernike descobriu os princípios do contraste de fase (ver pág. 146 ), que permitia visualizar estruturas internas de objetos transparentes. Nas décadas seguintes houve grandes avanços na produção de microscópios altamente especializados como, por exemplo, os microscópios de emissão de campo, que tornaram possível a visualização da matéria no nível atômico; mais tarde, em 1951, Erwin W. Müller e Kanwar Bahadur inventaram o microscópio iônico de campo, permitindo a visualização de
Figura 5 – Ernst Ruska, inventor do microscópio eletrônico.
átomos individuais pela primeira vez. No ano seguinte, Georges Nomarski patenteou a microscopia de contraste de interferência diferencial (differential interference contrast microscopy – DIC – pág. 52 ), uma técnica de microscopia de luz que permite a visualização pseudotridimensional de estruturas sem a necessidade de adição de corantes ou outras substâncias; este tipo de microscopia também é conhecido pelo nome do seu inventor. Marvin Minsky inventou e patenteou o microscópio de varredura confocal (capítulo 7), após a construção de um protótipo que despertou pouco interesse à época. Esse tipo de microscopia “tomou corpo” a partir da invenção do laser e começou a ser usado mais largamente a partir de 1969. Nos anos 1950 os cientistas desenvolveram os primeiros projetos de fibra óptica, uma tecnologia que permitia a condução de luz dentro de fibras com pouca perda de sinal; fibras ópticas são hoje largamente utilizadas nos microscópios de luz. Em 1960 o norte-americano Theodore Maiman, utilizando um pequeno bastão de rubi, construiu o primeiro LASER ( L ight A mplification by S timulated E mission of R adiation ), que amplificava a radiação da luz visível. A partir da invenção de Maiman, uma revolução na óptica se fez. Lasers passaram a ser usados em diferentes situações como, por exemplo, na criação das primeiras holografias (imagens tridimensionais produzidas a partir dos objetos). Lasers mostraram-se promissoras ferramentas de comunicação, uma vez que um feixe de luz desse tipo pode carregar tanta informação quanto a contida em milhares de canais de rádio; a associação dessa tecnologia com a da fibra óptica permitiu o desenvolvimento de novos meios para transmitir sinais e assim revolucionar os processos de comunicação e transmissão de dados. Computadores eletrônicos já eram usados desde os anos 1940, mas eram muito caros e grandes. Foi nos anos 1970 que aconteceu a evolução dos computadores pessoais (PC), o que levou a um desenvolvimento muito rápido das tecnologias digitais e facilidade na aquisição e análise de dados de imagens. A consolidação dessas novas tecnologias se deu com o surgimento, em 1991, da World Wide Web , uma rede global de computadores inicialmente projetada para a troca de informações entre cientistas, mas que acabou tomando conta do nosso dia-a-dia.
do tubo. Esse conjunto tem por objetivo, além da simples ampliação da imagem, corrigir aberrações ópticas inerentes á construção de lentes, como esférica, cromática e outras. O tipo mais simples (e barato) de lente objetiva é a objetiva acromática , desenhada para a correção cromática, no plano axial, de dois comprimentos de onda (vermelho e azul). A aberração cromática é produzida pelo desvio angular não igual de diferentes comprimentos de onda quando atravessam uma mesma seção da lente, fora de seu eixo axial (Figura a). Essas lentes também têm correção para aberração esférica no comprimento de onda da luz
verde. Aberração esférica é a que se observa quando raios luminosos de um mesmo comprimento de onda incidem em diferentes pontos da lente; aqueles que passam mais próximos ao eixo axial têm um desvio angular menor que os que atravessam a borda da lente, levando a distorções de foco da imagem (Figura b ). Devido ao limitado poder de correção de aberrações ópticas da lente acromática, as observações e fotomicrografias coloridas podem aparecer com distorções como um halo verde (geralmente chamado de cor residual). Para contornar esse problema, pode-se utilizar um filtro verde para iluminar o objeto, bem como obter fotografias utilizando-se filme preto-e-branco. Outra limitação dessas objetivas é a falta de correção para curvatura de campo , uma aberração provocada pela própria curvatura da lente em sua construção (Figura 9). Lentes objetivas geralmente são
Figura 8 – Lentes objetivas com diferentes correções de aberrações ópticas. Todas ampliam a imagem em 10x.
Figura 7 – Aberração cromática (a) e esférica (b) de lentes.
planoconvexas ou biconvexas, fazendo com que a produção da imagem não aconteça em um plano achatado, mas num plano curvo. As objetivas plan acromáticas são as que oferecem esse tipo de correção. As objetivas semi-apocromáticas , também conhecidas como fluoritas (Figura ), têm uma melhor correção para aberração esférica (corrigem duas cores). Por serem feitas com formulações especiais de vidros, oferecem maior contraste e transparência que as acromáticas, além de permitir a construção de lentes com aberturas numéricas maiores. São bastante adequadas para fotomicroscopia, quando se pensa na relação custo/benefício. O mais alto nível de correção de aberrações pode ser encontrado nas objetivas apocromáticas (Figura ), que corrigem aberração cromática para três cores (azul, verde e vermelho) e aberração esférica para duas cores. Algumas dessas lentes (fluoritas também) são desenhadas para a correção de aberrações cromática e esférica de quatro cores (azul- escuro, azul, verde e vermelho); são lentes de alto desempenho e também de alto custo, ideais para fotomicrografias coloridas usando luz branca. Evidentemente, possuem abertura numérica elevada, aumentando o poder de resolução do equipamento. Finalmente, da mesma forma que existem as objetivas plan acromáticas, as que possuem correção para curvatura de campo são conhecidas por plan fluoritas e plan apocromáticas; essas lentes são o que existe de mais sofisticado e caro em microscopia, mas como resultado tem-se imagens de alta qualidade e resolução. Na observação direta de um material, a curvatura de campo pode não ser um fator limitante, pois basta ajustar o foco para a periferia ou para o centro do campo visual; entretanto, quando se pensa em fotomicrografia ou filmagem de um objeto, as lentes plan fazem a diferença. A Tabela 1 traz um resumo dos tipos de lentes objetivas e as correções proporcionadas por elas. Para se conseguir resolver o problema da curvatura de campo é preciso colocar um número considerável de lentes no caminho óptico, como pode ser observado na Figura 10.
Figura 7 – Aberração de curvatura de campo. Apesar de o objeto ser plano, a imagem projetada pela lente é curva, por conta da curvatura da lente.
Abertura Numérica (AN) : este valor representa, simplificadamente, o ângulo máximo de entrada de luz vinda do objeto, o que depende também do índice de refração do meio interposto entre objeto e objetiva, e é essencial no cálculo do limite de resolução da lente; em outras palavras, informa sobre o que pode ou não ser enxergado com aquela lente (ver Formação da Imagem em Microscopia de Luz , pág. 30 ). Algumas objetivas especificamente desenhadas para microscopia de fluorescência de luz transmitida e microscopia de campo escuro podem vir equipadas com um diafragma íris interno que permite regular a quantidade de luz que entra na objetiva e, consequentemente, sua abertura numérica. Comprimento mecânico do canhão/tubo : é um valor que indica, em milímetros, a distância entre o topo da objetiva, onde ela é inserida no revólver, e o ponto de inserção da lente ocular. Esse valor geralmente é de 160, 170 ou 210, mas pode
haver outros. Para microscópios com sistema de óptica infinita, o símbolo ∞ vem
inscrito no lugar de um valor fixo. Nesse sistema, o canhão tem uma lente em seu interior, responsável pela formação da imagem intermediária. Espessura recomendada da lamínula : geralmente, as objetivas que trabalham em microscopia de luz transmitida são desenhadas para capturar a imagem de um objeto que está recoberto por uma lamínula de vidro. Atualmente a espessura padrão das lamínulas é de 0,17 mm ± 0,01 mm. Essa especificação é necessária para que se possa utilizar de forma eficiente a abertura numérica da lente objetiva, especialmente aquelas que possuem uma distância de trabalho bastante curta e abertura numérica maior. Correções ópticas : como discutido anteriormente, as objetivas podem ser construídas de forma a minimizar o efeito das aberrações ópticas inerentes às lentes. As abreviaturas Achro , Acro são usadas para indicar lentes acromáticas; Apo para as
Figura 9 – Geometria de uma lente simples. A razão entre as distâncias a e b é o aumento da imagem produzida pela lente, em número de vezes. F - ponto focal da lente.
apocromáticas; Fl , Fluar , Flour , Neofluar ou Fuotar para as fluoritas; as que possuem correção para curvatura de campo trazem inscrito Plan , Pl , EF , Plano , Plan Apo ou Acroplan. Também pode ser encontrada a abreviatura Ultrafluar em objetivas que são construídas com vidro transparente a comprimentos de onda menores que 250 nanômetros (ultravioleta), mais adequadas para microscopia de fluorescência. Distância de trabalho : É a distância entre a lente frontal da objetiva e a superfície da lamínula quando o objeto está em foco. Geralmente, quanto maior a ampliação de uma lente, menor a distância de trabalho. Algumas objetivas são desenhadas para longas distâncias de trabalho e possuem a inscrição LWD ( L ong W orking D istance) ou ULWD ( U ltra L ong W orking D istance), comumente utilizadas em eletrofisiologia ou outras aplicações que necessitem de maiores distâncias entre a lente e o objeto, como para observações de células em placas de Petri ou frascos de cultivo em microscópio invertido. Objetivas com distância de trabalho curta geralmente possuem um mecanismo retrátil na porção que fica próxima ao objeto, o que diminui o risco de quebra da lamínula/lâmina por pressão da objetiva, bem como os danos que podem ser causados nela própria. Meio de imersão : a maioria das lentes objetivas é construída para trabalhar com ar entre ela e a lamínula. Entretanto, para garantir um valor mais alto de abertura numérica e, consequentemente, uma melhor resolução da imagem, algumas lentes são desenhadas para trabalhar com outros meios interpostos, como óleo, água ou glicerina. As objetivas que utilizam algum meio de imersão geralmente possuem um anel colorido gravado na sua ponta, como indicação do meio necessário (Tabela 2) e também possuem siglas ( Oil , HI ou OEL para óleo, Wi para água). O anel é gravado na extremidade da lente, próximo ao objeto. Códigos de cores de ampliação : a maioria dos fabricantes de microscópios marca suas objetivas com códigos de cores para uma rápida identificação da ampliação (Tabela 3). Esses códigos são bastante úteis quando se tem um revólver com várias
Tabela 2 – Códigos de cores de meios de imersão em objetivas. Cor do anel Tipo de imersão preto óleo laranja glicerol branco água vermelho especial
intermediária produzida pela objetiva e projetá-la a uma distância de 25 cm do observador, do mesmo lado do objeto; ou seja, elas produzem uma imagem ampliada, virtual e direita (não invertida) da imagem intermediária. Normalmente, as oculares de um microscópio são construídas para trabalharem em conjunto com as objetivas daquele mesmo microscópio, trazendo assim melhores resultados, pois podem trazer correções adicionais das aberrações ópticas não totalmente corrigidas pelas objetivas. Essas lentes podem ser construídas com dois arranjos básicos: negativas (Figura 12 a), quando o seu diafragma fica entre as lentes, e positivas , quando o diafragma fica anterior às lentes da ocular (Figura 12 b). As oculares negativas são construídas com duas lentes plano-convexas, sendo que a face convexa fica voltada para o objeto em ambas; entre elas, um diafragma fixo determina o diâmetro do campo visual do equipamento. Essas lentes equipam a maioria dos microscópios de uso rotineiro, com objetivas acromáticas simples, e geralmente não são bem corrigidas para aberrações ópticas. Oculares negativas com correções possuem duas ou mais lentes cimentadas juntas, acima do diafragma. Uma ocular somente com a inscrição da ampliação (em número de vezes) em seu corpo provavelmente é uma ocular negativa simples. As oculares positivas são também compostas por duas lentes, mas ambas acima do diafragma fixo. Nesse caso, apesar de também ambas as lentes serem plano-convexas, a face convexa de uma fica voltada para a face convexa da outra, e as faces planas ficam voltadas para o observador e para o objeto. Uma vez que a imagem intermediária se forma exatamente no diafragma da ocular, este local se torna adequado para se colocar objetos como gratículas de medidas (Figura 13 ), pois apareceram em foco conjugado com a imagem observada.
Figura 10 – Os dois tipos mais comuns de lentes oculares, positiva (esquerda) e negativa (direita).
Figura 11 – Gratículas de medição que podem ser colocadas no diafragma da lente ocular.
Essas oculares mais simples, também conhecidas por Huygeniana (negativa) e Ramsdeniana (positiva), não possuem correção para aberrações cromáticas residuais presentes na imagem intermediária, especialmente para objetivas de grande aumento (acima de 40x). Algumas oculares fazem essa correção; o tipo mais sofisticado é a ocular periplan, construída com sete lentes, algumas cimentadas juntas formando dupletes. Essas lentes também melhoram a correção para curvatura de campo, permitindo uma ampliação do campo visual sem acrescentar distorções indesejadas na imagem; entretanto, cada ocular é desenhada para trabalhar com objetivas específicas, portanto é importante o uso dessas lentes seguindo a indicação dos fabricantes. Nos dias atuais, praticamente toda a correção das aberrações e distorções ópticas é feita nas objetivas e/ou pela lente do canhão (nos equipamentos com óptica infinita), tornando as oculares apenas responsáveis pela ampliação da imagem intermediária, que já tem alta qualidade. Da mesma forma que para as lentes objetivas, é possível encontrar outras informações gravadas nas oculares, além da ampliação linear da imagem. Assim, relativamente ao campo visual ( viewfield em inglês) pode-se ter UW ou UWF ( U ltra W ide F ield), SW ou SWF ( S uper W ide F ield); H ou HE ( H igh E yepoint) indicam lentes que podem ser usadas com o olho posicionado mais distante da ocular (ideal para quem usa óculos); lentes com fatores de compensação de aberrações vêm inscritas com K , C , Comp ou Compens. Muitas oculares possuem ajuste fino de foco (girando-a em seu próprio corpo ou com um parafuso de ajuste), o que permite o trabalho de pessoas com diferentes graus de miopia em cada olho em um microscópio binocular, e um parafuso de fixação, que as torna mais seguras contra quedas. Além disso, é cada vez mais comum que elas venham equipadas com protetores de borracha que, além de facilitar o encaixe dos olhos, permite eliminar a luz ambiente tornando mais clara e com maior contraste a imagem observada. Entretanto, em equipamentos multiusuários isso pode ser um transtorno, uma vez que a proteção de borracha pode funcionar como veículo para a transmissão de infecções por contato, como conjuntivite. As oculares geralmente ampliam de 10 a 20 vezes a imagem intermediária. Valores maiores que esses geralmente levam ao que se chama “ampliação vazia”, ou seja, uma ampliação que não traz mais informações ou detalhes da imagem. Além disso, quanto maior a
relação de combinações entre objetivas e oculares que se encaixam dentro do conceito discutido.
CONDENSADORES
O condensador é uma parte essencial do microscópio no quesito iluminação do objeto. Ele recebe os raios luminosos da fonte de iluminação e os concentra sobre o objeto, formando um cone de luz que vai entrar na objetiva, pela sua lente frontal. O posicionamento correto do condensador e o ajuste adequado de sua abertura numérica, regulável por um diafragma iris (colocado logo abaixo das lentes condensadoras) vai garantir uma iluminação que tenha a melhor correlação entre contraste e resolução. Esses ajustes são críticos especialmente quando se trabalha com microscopia quantitativa ou com fotomicroscopia. O condensador mais simples (e mais barato) que existe é o condensador de Abbe (Figura 14 a), uma homenagem a Ernst Abbe (Figura 3), um grande físico que, através de seus estudos, permitiu enormes avanços em microscopia de luz. Ele é composto por um sistema de duas lentes, sem correção de aberrações ópticas, o que pode facilmente ser verificado pela observação de halos coloridos quando se focaliza e se observa a imagem do diafragma de campo através da ocular, especialmente com objetivas de maior abertura numérica. Apesar disso, o condensador de Abbe ainda é o mais comumente encontrado em microscópios, tendo ainda a vantagem de permitir a formação de cones amplos (de grande abertura numérica – AN) ao mesmo tempo em que é adequado para o uso com objetivas com distância de trabalho grandes. Condensadores um pouco mais sofisticados são os aplanáticos (com correção para aberração esférica) (Figura 14b) e os acromáticos (correção para aberração cromática) (Figura 14c). Ambos contêm um número maior de lentes em sua construção, mas geralmente possuem uma abertura numérica menor que o condensador de Abbe; são ideais para o
Tabela 4 – Combinações de oculares e objetivas que se encontram na faixa de aumento útil da imagem (500 a 1000 x ANobj). objetiva (AN)
Oculares 10x 12,5x 15x 20x 25x 2,5x (0,08) sim sim 4x (0,12) sim sim sim 10x (0,35) sim sim sim sim 25x (0,55) sim sim sim sim 40x (0,70) sim sim sim 60x (0,95) sim sim sim 100x (1,42) sim sim
trabalho com objetivas a seco e para fotomicroscopia colorida (acromático) ou preto-e-branco (aplanático). O nível mais alto de sofisticação é encontrado nos condensadores acromáticos-aplanáticos (Figura 14d), que têm oito lentes em sua construção (dois dupletes e quatro lentes simples) e são praticamente livres de aberrações.
As informações que podem ser encontradas gravadas em um condensador são a sua abertura numérica (AN), o tipo de correção para aberrações ópticas e uma escala graduada que indica o valor da abertura numérica que se obtém ao abrir ou fechar o diafragma iris (também chamado de diafragma de abertura ). Alguns fabricantes inscrevem, nessa escala graduada, marcas “ideais” para se utilizar em combinação com determinada objetiva (ver Formação da Imagem em Microscopia de Luz, pág. 30 ). Esse ajuste se faz necessário, pois cada objetiva possui uma abertura numérica (AN) diferente; por exemplo, para uma objetiva de 10x com AN 0,25 a abertura do condensador deve ficar em aproximadamente 0,20 (80% da AN da objetiva). Um fator importante a ser considerado na aquisição de um condensador é sua abertura numérica, que deve ser pelo menos igual à da objetiva com maior abertura numérica que será utilizada no equipamento, pois assim pode-se garantir que não haverá perda de resolução na formação da imagem. Ou seja, se a objetiva com maior abertura numérica em um microscópio for 1,3 (imersão em óleo), o condensador também deve ter essa abertura numérica e também deve ser usado em imersão para que se garanta a máxima resolução. Caso não se utilize o óleo de imersão, a abertura numérica máxima do sistema ficará restrita
Figura 12 – Tipos de condensadores e suas correções de aberrações ópticas.
facilmente seja posicionado, tendo como inscrições H para campo claro, DF ( D ark F ield) para campo escuro, PH ( PH ase Contrast) para contraste de fase ou DIC para contraste de interferência diferencial.
LENTE COLETORA DE LUZ Antes que a luz atinja o condensador, na forma de um cilindro luminoso, ela foi capturada da fonte de iluminação pela lente coletora de luz (Figura 24 e Figura 25), que normalmente está posicionada próxima à lâmpada. Essa lente captura os raios luminosos e os direciona na forma de um cilindro de luz que percorre o caminho óptico até o condensador, onde será convergido em um cone de luz que incidirá sobre o objeto. Normalmente, a lente coletora fica bastante próxima à lâmpada para que a maior quantidade possível de fótons emitidos possa ser capturada. Além disso, também é comum existir um espelho côncavo posicionado atrás da lâmpada, que reflete raios luminosos em direção à lente. Tudo isso para que se possa ter o melhor aproveitamento da luz emitida pela fonte de iluminação.
LENTE DE CAMPO Uma das lentes que fica na base do microscópio, após a lente coletora de luz, é a lente de campo (Figura 25), que é geralmente móvel, permitindo o ajuste do foco do filamento da lâmpada, projetado no plano focal anterior do condensador. Esse assunto é mais bem discutido no item Métodos de Iluminação, na página 37.
FONTES DE ILUMINAÇÃO
Não há microscopia de luz sem luz! A fonte de luz de um microscópio é quase tão importante quanto suas lentes, pois ela também será responsável pela resolução da imagem. Serão discutidos aqui os mais comuns dentre muitos sistemas de iluminação que hoje podem ser encontrados em diferentes tipos de microscopia, com diferentes finalidades. (^) Figura 15 – Tipos de lâmpadas incandescentes de tungstênio e halogênio utilizadas em microscopia de luz.
O tipo mais comum de iluminação é obtido por lâmpadas incandescentes. Na grande maioria dos equipamentos, a iluminação para campo claro é fornecida por uma lâmpada de halogênio-tungstênio , que geralmente é colocada na base do microscópio ou em um compartimento localizado na parte traseira do equipamento, junto à base (Figura 25). Este último layout é mais adequado, uma vez que estas lâmpadas emitem uma quantidade grande de calor e este é dissipado fora do equipamento. Essas lâmpadas (Figura 17) possuem geralmente uma potência de 20 a 100 watts e trabalham com corrente de 6, 12 ou 24 volts, permitindo o equivalente a 2.800 lumens. A temperatura de cor na lâmpada varia de acordo com a corrente fornecida, controlada por um potenciômetro geralmente acoplado à base do microscópio. Quando em corrente máxima, sua temperatura de cor é de aproximadamente 3.350 K (luz branca). O perfil de emissão dessas lâmpadas pode ser observado na Figura 18; elas emitem luz em todo o espectro da luz visível, pouca radiação ultravioleta e muito infravermelho. É preciso um cuidado muito grande na manipulação dessas lâmpadas, que aquecem muito quando em funcionamento e podem causar queimaduras graves. Quando têm que ser substituídas, o ideal é esperar em torno de 20 minutos após apagada, para que esfrie. Outro cuidado importante é nunca tocar no bulbo de vidro quando de sua manipulação, pois as marcas de dedos no vidro serão queimadas e diminuirão a vida útil da lâmpada; sua manipulação sempre deve ser feita com um papel ou mesmo com o plástico na qual ela vem embalada. Para microscopia de fluorescência (ver pág. 57 ) ainda são comuns as lâmpadas de arco de mercúrio , conhecidas pela sigla HBO ( H para representar Mercúrio – Hg – , B é o símbolo para luminância e O para resfriamento não forçado). Essas lâmpadas (Figura 19) possuem uma intensidade de luz muito maior que as halógenas (até 100 vezes mais brilhantes) e emitem luz ultra-violeta em quantidade. Seu funcionamento é
Figura 16 – Espectro de emissão de uma lâmpada de tungstênio usada em microscopia.
Figura 17 – Lâmpada de arco de mercúrio.
