Sebenta de microbiologia alimentar, Notas de aula de Químca dos Alimentos

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Sebenta Microbiologia Alimentar

(Prof. Fernando Tavares e Prof. João Cabral)

Giovanna Calvão

Índice programático

Cap. 1: Introdução à microbiologia alimentar; Cap. 2: Ubiquidade e diversidade dos microrganismos. Microrganismos produtores de alimentos, de alteração e patogénicos. Plasticidade genómica e rápida multiplicação dos microrganismos. Cap. 3: Macronutrientes, micronutrientes e fatores de crescimento. Categorias nutricionais de microrganismos. Fatores que condicionam o crescimento de microrganismos. Cap. 4: Curva de crescimento. Contagens diretas de células. Cap. 5: Cultura em sistema contínuo ou aberto. Metabolitos primários e secundários. Cap. 6: Fatores intrínsecos e extrínsecos. Potencial redox. Cap. 7: Bactérias patogénicas em alimentos. A presença de Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens e C. botulinum, Bacillus cereus, Brucella, Campylobacter e Yersinia enterocolitica. Reservatório da bactéria no ambiente, toxinas, contaminação e crescimento nos alimentos, dados clínicos e saúde pública. Cap. 8: pH e qualidade de alguns alimentos. Conceitos ecológicos em microbiologia de alimentos. Cap. 9: As bactérias do ácido láctico. As bifidobactérias. A importância da composição da flora intestinal para a saúde do homem. Probióticos. Prebióticos. Simbióticos. Metabióticos. Microbiologia do iogurte. Microbiologia do quefir. Microbiologia do queijo. Microbiologia do pão, do vinho e da cerveja. Microrganismos indicadores (indicator) e substitutos (surrogate). Microbiologia dos produtos embalados. Cap. 10: Aditivos alimentares. Conservantes. Elementos antimicrobianos de origem animal. Elementos antimicrobianos de origem vegetal e microbiana. Técnicas de preservação de alimentos. Cap. 11: Avaliação da qualidade microbiológica dos produtos vegetais. Microrganismos indicadores, sinalizadores e sentinelas. FOODNET CANADA - O sistema nacional Canadiano integrado de vigilância microbiológica alimentar.

História

3180 AC – 1ª Dinastia do Egipto, Imperador Shemsu, afetada por uma grande epidemia (peste); 1000 AC – Secagem, fumeiro, salga e especiarias utilizadas na China para conservação de alimentos. 79 – Epidemia, provavelmente de antrax, em Itália. Surge após a erupção do Vesúvio e provoca mortalidade em gado. Simultaneamente uma peste de origem desconhecida causa grande mortalidade na população humana ( Bacillus anthracis ). 857 – Referências a uma intoxicação alimentar que causa vómitos, sensação de calor ou frio intenso, dores musculares e alucinações: ergotismo ou Fogo de S. António. Intoxicação provocada pelo esporão-do-centeio ( Claviceps purpurea ), que produz alcalóides que contaminam o pão. 900 – Primeira referência ao botulismo ( Clostridium botulinum ). Imperador Leo VI do império Bizantino proíbe o consumo de sangue em alimentos. 1070 – Um pedaço de queijo fresco esquecido por um pastor numa cave na região de Roquefort fica contaminado por um bolor esverdeado que mais tarde foi classificado como Penicillium roqueforti. Surgia assim o Queijo Roquefort. 1800 – É usada a lixívia para a sanitização da água de consumo. 1826 – Pandemia de cólera ( Vibrio choleare ) surge no sudeste da Ásia e alarga- se à Europa, Inglaterra em 1831 e Paris em 1832. Estende-se ao Canadá no verão de 1832 transmitida por emigrantes Irlandeses e no mesmo ano aos USA. 1846 – Grande fome na Irlanda provocada pelo míldio da batata ( Phytophthora infestans, oomiceto ). Um milhão de mortes e um milhão de emigrados. 1846 – John Snow apresenta os seus trabalhos sobre a transmissão da cólera pela água. Localiza efluentes da contaminação. 1856 – William Budd sugere a transmissão da febre tifoide através de águas contaminadas com as fezes de pessoas infetadas. Sugere a sanitização química da água. 1861 – Pasteur apresenta as experiências com os frascos de pescoço-de-cisne. O esclarecimento final da controvérsia surge com as experiências de Ferdinand Cohn (1875 e 1876) que revela a resistência de esporos bacterianos ao calor. 1890 – Descoberta por Knut Helge Faber a exotoxina do tétano. 1892 – Richard Friedrich Johannes Pfeiffer introduz o termo endotoxina relativo a bactérias cujos filtrados de cultura não provocam doença. Entre as doenças provocadas por endotoxinas contam-se a febre tifoide, cólera e pneumonia.

Crescimento bacteriano

As bactérias geralmente reproduzem-se assexuadamente por fissão binária , nesse processo ocorre a replicação do cromossoma e uma célula divide-se em duas, de seguida ocorre a divisão do cromossoma replicado e o desenvolvimento de uma parede celular transversal. Pode também ocorrer gemulação , esporulação ou fissão múltipla. O crescimento por fissão binária pode ser representado como o logaritmo de células viáveis em função do tempo de incubação resultando numa curva que apresenta 4 fases distintas: Fase lag – também chamada de fase de espera, não há um aumento do nº de células, no entanto, o metabolismo das células é elevado pois encontram-se a sintetizar novos componentes. Esta fase é necessária pois podem ser células velhas que não possuam enzimas/ATP necessários para o crescimento, podem estar danificadas e a precisar de tempo para recuperar, etc. Varia com a condição de microrganismos e com a natureza do meio; Fase exponencial (log) – há o crescimento rápido dos microrganismos, dividem-se e duplicam o seu nc em intervalos regulares, é uma reta cuja inclinação depende da velocidade da divisão das bactérias. A população é mais uniforme em termos de propriedades químicas e físicas durante estas fase e, assim, culturas nesta fase são normalmente usadas em estudos bioquímicos e fisiológicos;

O tempo que é necessário para uma população duplicar em tamanho, isto é, o tempo médio de geração (g), pode ser calculado por: O tempo médio de geração (g) é o inverso da constante da taxa média de crescimento (k) Os tempos de gerações variam bastante com as espécies de microrganismos e com as condições ambientais, podendo variar entre menos de 10 minutos até vários dias – no entanto, é preciso ter em conta que os tempos de geração na natureza são normalmente maiores que em cultura. Cultura em sistema fechado – microrganismos passam pelas fases mencionadas acima – lag, exponencial, estacionária e morte/declínio. Cultura em sistema contínuo ou aberto – consiste num sistema que mantém as culturas sempre em fase exponencial através do fornecimento constante de nutrientes (meio de cultura fresco, p.e) e pela remoção contínua de resíduos; ↳ Quimiostato : neste tipo de sistema o fluxo de entrada e saída de nutrientes mantém-se a um determinado valor de tal maneira que a velocidade de crescimento de cultura é ajustada à velocidade do fluxo

• o meio de cultura possui um nutriente essencial em quantidades limitantes. Permite, assim, estudar o crescimento microbiano e tem aplicações em várias indústrias; ↳ Turbidostato : inclui um dispositivo que lê a turvação do meio e ajusta a entrada e saída de nutrientes de acordo com essa leitura, mantendo assim o nível populacional da cultura e a densidade celular.  Quantificação do crescimento microbiano Existem dois modos de quantificar o crescimento microbiano para determinar as taxas de geração e tempos de geração – pelo aumento do nº de células ou pelo aumento da massa total da população. Assim, para se determinar o nº de UFC (células viáveis):
  1. Método de diluição em placa Quando a concentração é grande, preparam-se várias diluições seriadas numa sequência de 1:10 para se semear cada uma dessas diluições num meio nutritivo, usando alíquotas, onde as bactérias se poderão reproduzir

e formar colónias. No final, escolhe-se a placa que tiver entre 15- 150 colónias e conta-se o nº de colónias, multiplicando-se pelo fator de diluição.

2. Método de sementeira por espalhamento (spread plate) A amostra diluída deve ser pipetada sobre a superfície do meio sólido e espalhado com uma vareta de vidro (semeador de vidro) dobrada em L de forma homogénea, vão-se, então, formar colónias isoladas à superfície. Para haver sucesso no isolamento de colónias é necessário que o nº de bactérias viáveis presentes não seja muito elevado. Obs : as placas vão a incubar em posição invertida, pelo que é necessário que o meio esteja sólido.
3. Método por incorporação Pipeta-se primeiro a amostra diluída para a placa estéril e só depois é adicionado o meio de cultura apropriado, no estado liquefeito, misturando-se depois com cuidado. Neste método as colónias crescem tanto à superfície como no interior do meio usado, ou seja, é um ponto positivo para os microaerófilos (crescem em meios com quantidades baixas de O 2 – anaerobiose).

Categorias nutricionais Fonte de carbono Fonte de energia Exemplos Fotoautotrófico CO 2 Luz algas, bactérias fotossintéticas Fotoheterotrófico Composto orgânico Luz bactérias fotossintéticas Quimiolitoautotrófico CO 2 Inorgânica eurobactérias nitrificantes e oxidantes de enxofre Quimiolitoheterotrófico Composto orgânico Inorgânica algumas arqueobactérias metanogénicas Quimiorganoautotrófico CO 2 Orgânica eurobactérias metilotróficas autotróficas Quimiorganoheterotrófico Composto orgânico Orgânica fungos, protozoários e a maioria das eurobactérias Os microrganismos quimiorganoheterotróficos (quimioheterotróficos) representam a maioria dos patogénicos , ou seja, estes obtêm a energia através de compostos orgânicos, usam substâncias orgânicas para obtenção de energia e obtenção de carbono. Apesar de uma espécie em particular normalmente pertencer a apenas um dos tipos nutricionais, alguns mostram uma grande flexibilidade metabólica e alteram os seus padrões metabólicos em resposta a padrões ambientais.  Fatores de crescimento Os microrganismos normalmente crescem e reproduzem-se quando minerais e outras fontes de energia, carbono, etc são fornecidas pois possuem enzimas e vias necessárias para sintetizar todos os componentes celulares necessários para o seu crescimento. Porém, existem alguns que não apresentam certas enzimas essenciais e não são capazes de produzir constituintes indispensáveis, logo, terão de os obter a partir do ambiente em que se encontram. Assim, os fatores de crescimento são esses compostos que a célula precisa para crescer mas que não consegue sintetizar: aminoácidos são necessários para a síntese de proteínas, purinas e pirimidinas são necessárias para a síntese de ácidos nucleicos e vitaminas que sustêm o crescimento microbiano.

 Metabolismo microbiano O metabolismo pode ser dividido em duas partes principais:

1. Catabolismo - moléculas maiores e complexas são quebradas em moléculas mais pequenas e simples com a libertação de ATP. Alguma desta energia é armazenada e tornada disponível na forma de calor, o resto é libertado como calor;
2. Anabolismo – gasta a ATP armazenada no catabolismo na síntese de moléculas complexas a partir de outras mais simples. Usa energia de modo a aumentar a ordem do sistema; Os microrganismos usam, normalmente, uma das três fontes de energia: os fotolitotróficos capturam a energia solar, os quimiorganotróficos oxidam moléculas orgânicas para libertar energia e os quimiolitotróficos usam nutrientes inorgânicos como fontes de energia. Porém, podem ser flexíveis quanto a este aspeto e também quanto a nível de aceitadores de eletrões que são usados pelos quimiotróficos, distinguindo-se em:
3. Fermentação – o substrato é oxidado e degradado sem a participação de um aceitador de eletrões externo ou derivado; normalmente a via catabólica produz um intermediário como o piruvato que desempenha esse papel; a fermentação ocorre, normalmente, sob condições aeróbias, porém, pode ocorrer por vezes quando o O 2 está presente; Em microbiologia – processo fornecedor de energia no qual as moléculas orgânicas funcionam tanto como aceitadores de eletrões e dadores;
4. Respiração – usa aceitadores de eletrões ou derivados e subdivide-se em 2 tipos: a. Respiração aeróbica – o aceitador de eletrões final é o O 2 ; b. Respiração anaeróbica – o aceitador é usualmente inorgânico (p.e, NO 3 - , SO 42 - , CO 2 , Fe3+, SeO 42 - , e outros), mas aceitadores orgânicos como fumarato podem ser usados.

Fatores que afetam o crescimento de microrganismos em

alimentos

1. Temperatura Para todos os microrganismos existem 3 temperaturas importantes: temperatura mínima (abaixo da qual não há crescimento), temperatura ótima (onde o crescimento é máximo) e temperatura máxima (acima da qual não há crescimento pois as enzimas foram danificadas pelo calor). De acordo com a temperatura de crescimento é possível distinguir, pelo menos 3 grupos fisiológicos de bactérias: a. Psicrófilos : crescem entre a 0 ᵒC e 20 ᵒC (ex: bacillus psyrophilus , chlamydomonas nivalis ); b. Psicrotrófico: são capazes de crescer entre 0- 7 ᵒC e apresentam um crescimento ótimo entre 20- 30 ᵒC e um máximo a 35 ᵒC (ex: Listeria monocytogenes, pseudomonas fluorescens ); c. Mesófilo: desenvolvem-se entre 20- 45 ᵒC (ex: E.coli ); d. Termófilo: capazes de crescer a 40 - 70 ᵒC (ex: Bacillus stearothermophilus ); e. Hipertermófilo: apresentam um crescimento ótimo entre 80- 113 ᵒC (ex: sulfolobus ); Fatores extrínsecos (características do ambiente): Temperatura , humidade relativa, presença e concentração de gases (CO 2 e O 2 ). Fatores intrínsecos (características do substrato): Nutrientes disponíveis , pH , capacidade tamponante, potencial oxidação-redução , atividade de água (aw) , barreiras antimicrobianas e estruturas biológicas.

O fator mais importante da influência da temperatura no crescimento é a sensibilidade de reações catalisadas por enzimas : a temperaturas baixas, um aumento da temperatura aumenta a taxa de crescimento pois a velocidade de uma reação enzimática duplica a cada aumento de 10 ᵒC, logo, o metabolismo é mais ativo a maiores temperaturas até a uma certa temperatura em que se começam a danificar estruturas como as enzimas. Em alimentos são poucos os psicrófilos que causam problemas, porém, a Listeria monocytogenes e o Clostridium botulinum conseguem desenvolver-se a temperaturas baixas de - 0,4 ᵒC e 3,3 ᵒC, respetivamente, até 5 ᵒC, ou seja, conseguem desenvolver-se mesmo dentro do congelador ou frigorífico. A temperatura de crescimento é conhecida por regular a expressão de genes virulentos em certos patogénicos, por exemplo, a expressão de proteínas governada pelo plasmídeo virulento da Yersinia enterocolitica é alta a 37 ᵒC, baixa a 22 ᵒC e não detetável a 4 ᵒC. Neste caso, o importante não é o crescimento microbiano mas sim a produção de toxinas que são a causa das doenças. Tem também impacto na Listeria monocytogenes (organismos termosensível), quando inoculado partir de salsichas enlatadas a 48 ᵒC, o seu valor de D aumenta até 64 ᵒC. Subtemperaturas letais levam a bactéria a adquirir resistência à temperatura imposta, passando esta característica a gerações futuras. ↳ Problema : a temperaturas elevadas os alimentos vêm-se livres da maioria dos microrganismos, porém, as suas características organolépticas são alteradas.

3. pH O ph é a medida de atividade do ião hidrogénio numa solução e é definido como o logaritmo negativo da concentração desse ião (pH=−log[H+]). Os habitats nos quais os microrganismos crescem são vários, sendo que cada espécie apresenta uma gama de pH de crescimento definido e um pH ótimo para o crescimento, podendo ser distinguidas 2 classes: a. Acidófilos : o seu crescimento ótimo varia entre 0 e 5,5; é o caso da maioria dos fungos e de bactérias encontradas em fluídos gástricos, vinagre, sumo de frutos, alimentos fermentados, etc; b. Neutrófilos: o seu crescimento ótimo varia entre 5,5 e 8,0; é o caso da maior parte das bactérias e protozoários; c. Alcalófilos: o seu crescimento ótimo varia entre 8,5 e 11,5 (alcalófilos extremos crescem a um pH igual ou superior a 10,0); é o caso de bactérias encontradas em lagos e solos alcalinos; Usualmente as bactérias mantêm o pH interno perto do pH neutro para prevenir mudanças conformacionais nas suas estruturas como enzimas, ácidos nucleicos, fosfolípidos e proteínas. Variações drásticas no pH citoplasmático podem danificar a membrana plasmática e inibir a atividade de enzimas e proteínas de transporte membranar, se houverem alterações no pH externo há alterações a nível da ionização de moléculas e nutrientes, reduzindo, assim, a disponibilidade destas moléculas para o organismo. Os microrganismos possuem vários mecanismos que lhes permitem sobreviverem a alterações de pH e manterem a sua neutralidade tais como a presença de tampões internos, o facto da membrana plasmática ser relativamente impermeável a protões, etc. Por exemplo, se o pH externo descer a 5-6 a Salmonella Notas: em alimentos enlatadas sem acesso a O 2 , microrganismos como o Clostridium Botulinum desenvolvem-se ativamente. Notas: Pseudomonas aeruginosa é aeróbio obrigatório, a E.coli é anaeróbio facultativo e o Clostridium Botulinum é um anaeróbio obrigatório.

typhimurium e E. coli sintetizam uma gama de novas proteínas como parte da sua resposta de tolerância à acidez. A acidez é o principal fator que garante a conservação dos alimentos fermentados, podendo este fator ser combinado com outros que também promovem a sua conservação tal como o calor, adição de conservantes, etc. Como os alimentos de origem animal têm um pH mais alto que os de origem vegetal, aproximando-se da neutralidade (ex: carne logo após o abate, leite, peixe, ovos...), estão mais suscetíveis ao crescimento de microrganismos pois esse é o pH ótimo de crescimento para os mesmos. Existem exceções como os iogurtes e queijos que possuem um pH ligeiramente mais baixo tal como os vegetais e frutas devido aos processos fermentativos que sofreram. Resumindo: para alimentos com um pH > 4,5 há uma predominância de crescimento microbiano (patogénicos, esporângicas ou não, aeróbios ou anaeróbios, mesófilos ou termófilos), para alimentos com um pH entre 4,5 e 4,0 há uma predominância de leveduras oxidativas ou fermentativas e de bolores (em aerobiose) e de algumas bactérias formadoras de esporos ou não, já para alimentos com pH < 4,0 ficam restritos a quase que exclusivamente leveduras e bolores. ALIMENTOS pH Neutros Carne logo após o abate, leite, peixe... 7,0-6, Pouco ácidos Carne fresca, toucinho fumado, vegetais enlatados 6,5-5, Acidez média Vegetais fermentados, queijos 5,3-4, Ácidos Frutos, sumos de fruta, tomate, iogurte... 4,3-3, Muito ácidos Picles, citrinos <3,

Podemos ter duas classes de microrganismos no que toca à sobrevivência quando há valores baixos de aw: a. Halófilos : microrganismos que requerem a presença de NaCl para conseguirem crescer a. Halófilos fracos : organismos que necessitam da presença moderada de sal, como é o caso das espécies marinhas cujo crescimento ótimo requer 1-6% de NaCl; b. Halófilos moderados : organismos que conseguem suportar ligeiras reduções de aw mas cujo crescimento ótimo se verifica na ausência do soluto em questão (6-15% NaCl); c. Halófilos extremos : organismos que habitam ambientes muito salgados, requerendo 15-30% de NaCl, dependendo da espécie; b. Osmotolerantes : são capazes de manter uma concentração de solutos elevada de modo a reter água, crescendo em várias gamas de aw ou concentração osmótica. P.e, alguns fungos são osmotolerantes estando envolvidos na deterioração de alimentos secos e salgados; a. Osmófilos : organismos capazes de viver em meios com altas concentrações de açúcar; b. Xerófilos : organismos capazes de viver em ambientes muito secos. Apesar de microrganismos halófilos serem osmófilos , este último termo é mais usado para organismos que conseguem viver em ambientes com elevada % de açúcar.

Notas: Alimentos sem água são completamente seguros à temperatura ambiente, especialmente se estes forem liofilizados (quer dizer que não possuem água); no pão, a côdea tem um valor de aw menor que o do miolo, ou seja, serve de barreira antimicrobiana.

5. Barreiras antimicrobianas e estruturas biológicas Aditivos alimentares podem ser classificados de acordo com 6 funções primárias: preservação, melhoramento no valor nutricional, adição ou substituição de cor (sulfitos, nitritos), adição ou substituição de sabor (nitritos e alguns ácidos orgânicos), melhoramento na textura e auxiliares tecnológicos. Atualmente os consumidores estão a inclinar-se mais para alimentos que tenham características de alimentos frescos, ou seja, o uso de tratamentos extremos e/ou aditivos já não os satisfazem. a. Barreiras antimicrobianas – proteínas com ação enzimática ( lisozima , atua sobre os peptidoglicanos, destruindo assim a parede celular (Gram - )), as lactoperoxidases têm uma atividade tóxica sobre os microrganismos e as ferritinas são quelantes de ferro, atuando sobre os seus iões; b. Estruturas biológicas – epicarpo de um fruto, pele de um animal, côdea de um pão; As barreiras antimicrobianas são compostos químicos que são adicionados ou presentes nos alimentos que retardam o crescimento microbiano ou que causam a sua morte. Podem ser naturais (ocorrem livremente na natureza, como mostra a tabela abaixo), produzidas pelos microrganismos ou adicionadas ao alimentos.