PESQUISA SOBRE ELETROFORESE, Manuais, Projetos, Pesquisas de Bioquímica

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Eletroforese

A eletroforese de proteínas foi realizada pela primeira vez em 1937 (Arne Tiselius) É uma técnica simples, rápida e de grande poder informativo, atualmente é aplicada na análise de enzimas, proteínas e ácidos nucléicos, usada em estudo de taxonomia, bioquímica, fisiologia e genética humana para identificar DNA-fonte, plantas, animais e microrganismos. A eletroforese é o termo usado para descrever o movimento de partículas em um gel ou fluido dentro de um campo elétrico relativamente uniforme. A eletroforese pode ser usada para separar moléculas com base na carga, tamanho e afinidade de ligação que possuem. A técnica é aplicada principalmente para separar e analisar biomoléculas, como DNA, RNA, proteínas, ácidos nucleicos, plasmídeos e fragmentos dessas macromoléculas. Esta é uma das técnicas utilizadas para identificar DNA-fonte, como no teste de paternidade e na ciência forense. A eletroforese de ânion ou partículas carregadas negativamente é chamada anafonese. A eletroforese de cátion ou partículas carregadas positivamente é chamada de cataforese. Esse processo foi observado pela primeira vez em 1807 por Ferdinand Frederic Reuss, da Universidade Estadual de Moscou, que notou que as partículas de argila migraram em águas expostas a um campo elétrico contínuo.

Aplicação da Eletroforese

• Identificação de fungos, bactérias, nematoides, vírus, viróides.
• Estudo da genética: Teste de paternidade.
• Identificação dos clones, cultivares e linhagens.
• Estudos citogenéticos, ecológicos, bioquímicos.
• DNA recombinante, sequência de nucleotídeos.
• Amplificação de DNA.
• Compara o DNA encontrado no local do crime, possíveis suspeitos.
• Estudo da relação patógeno- hospedeiro Estudo da resistência a doenças.

Como funciona a Eletroforese

determinando a mobilidade das proteínas em gel que se submete à corrente elétrica, determinando o movimento involuntário de proteínas.

Eletroforese Capilar

Dentro de um tubo capilar de sílica fundida tem alta eficiência de separação, utiliza amostras pequenas e requer apenas alguns minutos para um ensaio. Um longo tubo capilar é preenchido com meio de eletroforese, uma amostra é injetada em uma banda estreita próxima a extremidade do ânodo do tubo, e as moléculas da amostra são separadas por sua mobilidade em direção ao polo carregado negativamente. Eletroforese capilar pode ser realizada em presença de anfólitos para separar proteínas por focalização isoelétrica, em presença de um gel poroso para separar proteínas por peso molecular, ou em presença de um componente micelar para separar por hidrofobicidade. Detectores que utilizam luz UV, fluorescência, espectroscopia Raman, detecção eletroquímica ou espectroscopia de massa tornam o método capilar sensível versátil. Essa técnica é aplicada em grande variedade de amostras, incluindo hidrocarbonetos aromáticos, vitaminas hidrossolúveis e lipossolúveis, amino ácidos, fármacos, proteínas e muitos outros. Utilizado no projeto Genoma Humano, para obter a sequência do DNA humano.

Separação de proteínas com base em massa molecular ou tamanho

Uma proteína submetida à força centrífuga move-se na direção da força a uma velocidade dependente de sua massa, sua velocidade em movimento é medida com um sistema de detecção óptico apropriado, e a partir da velocidade, o coeficiente de sedimentação é calculado em unidades Svedberg.

Proteínas apresentam diferentes cargas totais líquidas, depende do conjunto de aminoácidos que as compõem.

Cromatografia de Exclusão Molecular

Um gel poroso na forma de pequenas esferas insolúveis é frequentemente usado para separar proteínas por tamanho, em colunas cromatografia. Proteínas pequenas penetram nos poros do gel e tem maior volume de solvente para percorrerem na coluna do que proteínas maiores, que são estericamente excluídas dos poros, consequentemente, uma mistura de proteínas é separada por tamanho, as maiores são eluídas primeiro seguidas, pelas proteínas menores que são retardadas por seu acesso a um volume maior de solvente.

Eletroforese para análise do DNA

A análise de DNA por eletroforese é uma das técnicas fundamentais nos laboratórios de pesquisa e de diagnóstico. O princípio é baseado no fato da molécula de DNA possuir carga negativa em valores de PH neutro ou alcalino e consequentemente, quando aplicado ou imerso em uma matriz de gel submetida a um campo elétrico, migra em direção ao pólo positivo (anôdo). A velocidade da migração depende do tamanho da molécula. Por isso em um dado momento da eletroforese moléculas de tamanhos distintos se encontram em diferentes pontos da matriz. O DNA apresenta uma carga constante, são separadas em géis de agarose ou de poliacrilamida. Os géis são utilizados como matriz, por onde serão corridas as amostras com fragmentos de diferentes tamanhos, neste sentido os géis atuaram com “crivos moleculares”, impedindo o deslocamento das moléculas de um pólo ao outro da cuba de eletroforese. Quanto maior for a molécula mais difícil será a passagem da mesma pelo emaranhado do gel. O procedimento para separar RNA e proteínas segue o mesmo princípio.

Referências